Η επίδραση των επιπέδων ακετυλίωσης και μεθυλίωσης των ιστόνων στη ρύθμιση του βιολογικού ρολογιού των θηλαστικών

Abstract

The biological clock is a timing mechanism that allows organisms to regulate theirinvoluntary (e.g. body temperature) and voluntary (behavior) functions in such amanner so as to be able to optimally cope with the challenges of each phase of the 24-hour time period. The clock is an endogenous and self-sustained system that controls,to a lesser or greater extent, the transcription of a considerable number of genes. Themolecular mechanisms of biological clock function have been studied extensivelyduring this past decade and a significant amount of data have accumulateddemonstrating that specific histone post-translational modifications in the promoterregion of clock genes are associated with their transcriptional regulation.The general aim of the present thesis work is the investigation of how histone posttranslationalmodifications affect the expression levels of three clock genes (mper1,mper2 and mcry1). The first important finding was that, while the mRNA levels ofmper2 and mcry1 in synchronized cultures oscillate above and below those of thenon-synchronized cultures, the mRNA levels of the mper1 gene in the synchronizedcultures are always above those of the non-synchronized, even in the trough of itsrhythm. This peculiarity in the oscillation profile of mper1 mRNA levels was foundto be associated with the observed decrease in the histone H3 lysine 4 trimethylation(H3K4me3) levels at the mper1 promoter region around the binding site of theglucocorticoid receptor (GRE) during the 1-hour incubation period withdexamethasone. Of significance is the observation that this reduction in H3K4me3levels is maintained even after the dexamethasone synchronization period, in the timepointsthat correspond to both the peak and trough of circadian rhythm.However, the most significant findings of this thesis work came from theinvestigation of the effects of two substances originally selected for this study due totheir ability to inhibit class I and II (trichostatin A) and class III (nicotinamide)histone deacetylases. It was found that trichostatin A increases mper1 mRNA levels,while nicotinamide inhibits this increase. Of special interest is the finding thatnicotinamide was able to block the dexamethasone-induced acute response of the mper1 gene, i.e. the response that is responsible for the circadian synchronization ofcells. Moreover, especially significant is the fact that nicotinamide’s inhibitoryeffects, both in the case of dexamethasone, as well as in the case of trichostatin A, arenot due to its ability to inhibit the class III histone deacetylases (sirtuins). Rather, thisinhibition seems to be mediated by a molecular mechanism that is responsible for theregulation of the cell’s active methyl reservoirs, since the trimethylation levels ofH3K4 in the mper1 promoter region near the TSS were found to be significantlylower in the samples from the cultures that had been incubated with α combination ofdexamethasone and nicotinamide, as compared to those that had been incubated withdexamethasone alone. Given the fact that trimethylation of H3K4 was found to benecessary for the circadian expression of clock genes (Ripperger and Schibler, 2006;Katada and Sassone-Corsi, 2010), it can be concluded that the significant attenuationof H3K4 trimethylation in the mper1 promoter is the mechanism by whichnicotinamide exerts its inhibitory effects to this gene’s response to dexamethasoneand trichostatin A. In contrast to the significant decrease found in the mper1promoter, no differences in the total abundance of H3K4 trimethylation of the massprofile of the total nuclear histone fraction could be observed amongst the dex anddex/NAM samples. This finding strongly indicates that the observed changes in theH3K4 trimethylation status in the mper1 promoter are a local event, restricted tospecific chromatin sites.In vivo, glucocorticoids circulating in the blood play a fundamental role in theregulation of the biological clock in mammalian peripheral tissues. The nicotinamideconcentrations used in this study (10 mM, 50 mM) were much higher than thephysiological levels of nicotinamide found in mammalian tissues, which normallyrange from 11 to 400 μM (Ijichi et al., 1966; Hagino et al., Lee et al., 2007).Nonetheless, it has been shown that exogenous application of nicotinamide fornutritional, veterinary or medicinal purposes can increase the nicotinamideconcentration within the body to levels close to those that were used in this study(Kollenkirchen et al., 1992; Erb et al., 1998). Apart from the potential effects to clockfunction, the ability of nicotinamide to abrogate a gene’s response to the effects ofdexamethasone and trichostatin A through an alternative mechanism, not related tosirtuins and to ADP-ribosylation is by itself of extreme importance. Future workshould aim at elucidating the details of this mechanism and its importance within aphysiological context.

Το βιολογικό ρολόι αποτελεί ένα μηχανισμό μέτρησης χρόνου που επιτρέπει στουςοργανισμούς να ρυθμίζουν τις ακούσιες (π.χ. θερμοκρασία σώματος) και εκούσιες(συμπεριφορά) λειτουργίες τους με τέτοιο τρόπο ώστε να αντιμετωπίζουν καλύτερατις προκλήσεις κάθε φάσης του 24-ώρου. Είναι ένα ενδογενές και αυτοσυντηρούμενοσύστημα και ελέγχει, σε μικρότερο ή μεγαλύτερο βαθμό, την έκφραση ενός μεγάλουαριθμού γονιδίων. Την τελευταία δεκαετία έχει μελετηθεί εκτενώς ο μοριακόςμηχανισμός του βιολογικού ρολογιού, ενώ πληθώρα δεδομένων συνδέουν τηνέκφραση αρκετών από τα γονίδια του ρολογιού με την παρουσία συγκεκριμένωνμετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων των ιστονών στους υποκινητές τους.Γενικός στόχος της παρούσης εργασίας είναι η μελέτη του μηχανισμού με τονοποίο οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών επιδρούν στην έκφρασητριών γονιδίων του ρολογιού (mper1, mper2 και mcry1). Το πρώτο σημαντικόεύρημα ήταν ότι ενώ τα επίπεδα mRNA των mper2 και mcry1 σε συγχρονισμένεςκαλλιέργειες ταλαντώνονταν γύρω από μία θέση ισορροπίας που προσέγγιζε ταεπίπεδα έκφρασης των ασυγχρόνιστων καλλιεργειών, στην περίπτωση του mper1 οισυγχρονισμένες καλλιέργειες είχαν πάντα, ακόμα και στο ναδίρ του ρυθμού,υψηλότερα επίπεδα mper1 mRNA σε σχέση με τις μη-συγχρονισμένες. Αυτή ηιδιομορφία στο πρότυπο ταλάντωσης των επιπέδων mRNA του mper1 φαίνεται νασχετίζεται με την ελάττωση, κατά την μία ώρα επώασης με τη δεξαμεθαζόνη, τηςαφθονίας της τριμεθυλιωμένης στη λυσίνη 4 της ιστόνης Η3 (Η3Κ4me3) στηνπεριοχή του υποκινητή του mper1 γύρω από τη θέση δέσμευσης τουγλυκοκορτικοειδούς υποδοχέα (GRE). Εξαιρετικά σημαντικό είναι το γεγονός ότιαυτή η πτώση φαίνεται να διατηρείται και μετά το συγχρονισμό με τη δεξαμεθαζόνη,καθώς παρατηρήθηκε σε δείγματα από κιρκαδικούς χρόνους που αντιστοιχούν τόσοστο ζενίθ όσο και στο ναδίρ της ταλάντωσης.7στόσο, τα κύρια ευρήματα αυτής της εργασίας προέκυψαν από τις μελέτες με τονικοτιναμίδιο και την τριχοστατίνη Α, τα οποία είχαν αρχικά επιλεγεί γιατί είναιαναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών. +ιαπιστώθηκε ότι η τριχοστατίνη Ααυξάνει τα επίπεδα mper1 mRNA, ενώ το νικοτιναμίδιο καταστέλλει αυτήν τηναύξηση. Ξεχωριστό ενδιαφέρον έχει η ικανότητα του νικοτιναμιδίου να αναστέλλειτην οξεία απόκριση του γονιδίου mper1 στη δεξαμεθαζόνη, η οποία είναι υπεύθυνη για τον κιρκαδικό συγχρονισμό των κυττάρων. Επιπλέον, ιδιαίτερα σημαντικό είναιτο γεγονός ότι η ανασταλτική δράση του νικοτιναμιδίου, τόσο στην περίπτωση τηςδεξαμεθαζόνης όσο και στην περίπτωση της τριχοστατίνης Α, δεν οφείλεται στηνικανότητά του να αναστέλλει τις αποακετυλάσες των ιστονών της 3ης τάξης,(σιρτουΐνες). Αντιθέτως, η αναστολή της απόκρισης φαίνεται να ακολουθεί έναμοριακό μηχανισμό ο οποίος ρυθμίζεται από τα υφιστάμενα στο κύτταρο αποθέματασε ενεργό μεθύλιο, καθώς τα επίπεδα τριμεθυλιωμένης Η3Κ4 κοντά στο σημείοέναρξης της μεταγραφής του υποκινητή του mper1 ήταν σε σημαντικό βαθμόχαμηλότερα στα δείγματα των καλλιεργειών που είχαν επωαστεί με συνδυασμόδεξαμεθαζόνης και νικοτιναμιδίου, σε σχέση με τα δείγματα από τις καλλιέργειες πουείχαν επωαστεί μόνο με δεξαμεθαζόνη. +εδομένου του ότι η τριμεθυλίωση της Η3Κ4είναι απαραίτητη για την κιρκαδική έκφραση των γονιδίων του ρολογιού (Rippergerand Schibler, 2006; Katada and Sassone-Corsi, 2010), θεωρούμε ότι η πτώση τηςτριμεθυλιωμένης Η3Κ4 στον υποκινητή του mper1 είναι ο μηχανισμός με τον οποίοτο νικοτιναμίδιο αναστέλλει την απόκριση του γονιδίου στη δεξαμεθαζόνη και τηντριχοστατίνη Α. Αντιθέτως προς την πτώση στον υποκινητή του mper1, η συνολικήαφθονία της τριμεθυλιωμένης Η3Κ4 στο γενικό (μαζικό) πρότυπο του ολικούκλάσματος των ιστονών του πυρήνα, δεν εμφανίζει διαφορές μεταξύ dex καιdex/NAM δειγμάτων. Αυτό υποδηλώνει ότι οι παρατηρηθείσες αλλαγές στουποκινητή του mper1 αποτελούν μέρος ενός τοπικού φαινομένου, περιορισμένου σεσυγκεκριμένες μόνο περιοχές της χρωματίνης.In vivo, τα γλυκοκορτικοειδή του αίματος παίζουν θεμελιώδη ρόλο στη ρύθμισητου βιολογικού ρολογιού στους περιφερικούς ιστούς εντός του σώματος ενόςθηλαστικού. Οι συγκεντρώσεις νικοτιναμιδίου που χρησιμοποιήσαμε (10 mM και50 mM) είναι πολύ μεγαλύτερες από τα φυσιολογικά επίπεδα του νικοτιναμιδίουστους ιστούς των θηλαστικών, τα οποία κυμαίνονται μεταξύ 11 και 400 μΜ (Ijichi etal., 1966; Hagino et al., Lee et al., 2007). Εντούτοις, έχει δειχθεί ότι η εξωγενήςπαροχή νικοτιναμιδίου για διατροφικούς, κτηνιατρικούς ή ιατρικούς σκοπούς μπορείνα αυξήσει τη συγκέντρωση νικοτιναμιδίου εντός του σώματος σε επίπεδα κοντά σεαυτά που χρησιμοποιήσαμε στις καλλιέργειες (Kollenkirchen et al., 1992; Erb et al.,1998). Εξάλλου, πέρα από τις πιθανές επιπτώσεις στη λειτουργία του βιολογικούρολογιού, είναι εξαιρετικά ενδιαφέρουσα η ίδια η ικανότητα του νικοτιναμιδίου νααναστέλλει την απόκριση ενός γονιδίου στην δράση της δεξαμεθαζόνης και τηςτριχοστατίνης Α με έναν εναλλακτικό μηχανισμό, άσχετο με τις σιρτουΐνες και την ADP-ριβοζυλίωση. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να στοχεύουν στην αποσαφήνισηαυτού του μηχανισμού καθώς και στη φυσιολογική του σημασία.