Διερεύνηση σχέσης μεταξύ των μηχανισμών των οδών MME/NPs και NFkB/πρωτεασώματος στον ανδρογονο-ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη (AIP)

Abstract

INTRODUCTION Castration-resistance in prostate cancer is a critical event hallmarking a switch to a more aggressive phenotype. Upregulation of NFB activity and neuroendocrine differentiation are two mechanisms known to be involved in prostate cancer progression to castration resistance. We investigated the interrelations of these pathways using in vitro models of androgen-dependent (AD) and androgen-independent (AI) prostate cancer (PC). METHODSWe measured cellular levels, activity and surface expression of neutral endopeptidase (NEP), levels of secreted ET1, levels, sub-cellular localisation and DNA binding ability of NFB, IB levels and proteasomal activity in human native prostate cancer cell lines (LnCaP and PC3) and a transfectant line (WT-5), modelling AD and AI states. RESULTSAt baseline, AD cells were found to have upregulated NEP/NPs pathway with high NEP expression and activity and less secreted ET-1. In contrast, they exhibited a low-level activation of the NFB pathway associated with comparatively low 20S proteasome activity. The AI cells showed the exact mirror image, namely increased proteasomal activity resulting in a canonical pathway-mediated NFB activation, and minimal NEP activity with increased levels of secreted ET-1. Neuropeptides induced nuclear translocation of NFB in AI cells, also evident as increased DNA binding in mobility shift assay (EMSA), reduced total IB levels, and increased 20S proteasomal activity. AD cells showed no appreciable nuclear translocation upon neuropeptide stimulation, with less intense DNA binding signal on EMSA and decreased proteasomal activity. These effects were at least partially prevented by specific neuropeptide receptor inhibitors, as well as NFB, IKK and proteasome inhibitors.CONCLUSIONAnalysis of components of the two pathways at baseline has shown that these pathways exhibit an inverse and mirror image relationship in androgen-dependent (AD) and –independent (AI) states in vitro. Our results also support evidence for a direct mechanistic connection between the neutral endopeptidase/neuropeptides and NFB/proteasome pathways, with a distinct neuropeptide-induced profile in the more aggressive, AI cancer state. A combination therapy targeting both pathways may ultimately prove to be of benefit in clinical practice.

Η ανδρογονο-ανεξαρτησία (ή ορθότερα με βάση τον νεότερο όρο η ανθεκτικότητα στον ευνουχισμό) στον καρκίνο του προστάτη (PC) αποτελεί ένα πολύ σημαντικό γεγονός που σηματοδοτεί την πρόοδο της νόσου και την αλλαγή προς έναν επιθετικότερο φαινότυπο. Η νευροενδοκρινική διαφοροποίηση και η αύξηση της μεταγραφικής δραστηριότητας του NF-κΒ είναι δύο μηχανισμοί που έχουν ανεξάρτητα συνδεθεί με αυτή τη διαδικασία. Ερευνήσαμε τις σχέσεις αλληλεπίδρασης αυτών των οδών χρησιμοποιώντας in vitro μοντέλα ανδρογονο-εξαρτώμενου καρκίνου του προστάτη (AD) και μη ανδρογονο-εξαρτώμενου καρκίνου του προστάτη (ΑΙ).Μετρήσαμε τα κυτταρικά επίπεδα, τη δραστηριότητα και την μεμβρανική έκφραση της ουδέτερης ενδοπεπτιδάσης (ΝΕΡ), τα επίπεδα της εκκρινόμενης ΕΤ-1, τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά επίπεδα, την ενδοκυττάρια εντόπιση και το ποσοστό σύνδεσης του DNA του NF-κΒ, καθώς και την πρωτεασωμική δραστηριότητα σε φυσικές και διαμολυσμένες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου προστάτη, αντιπροσωπεύοντας πρότυπες καταστάσεις AD και ΑΙ καρκίνου.Σε σταθερή κατάσταση βρήκαμε ότι τα ανδρογονο-εξαρτώμενα κύτταρα είχαν ενεργοποιημένη την οδό NEP/NPs, με υψηλή έκφραση και δραστηριότητα NEP και χαμηλή εκκρινόμενη ΕΤ-1. Αντίθετα, παρουσίασαν χαμηλό επίπεδο ενεργοποίησης της οδού NFκΒ (κυτταροπλασματική εντόπιση, χαμηλά επίπεδα πυρηνικής πρωτεϊνης, χαμηλά ποσοστά σύνδεσης με DNA), με σύγχρονη σχετικά μειωμένη δραστηριότητα του 20S πρωτεοσώματος και αυξημένα κυτταρικά επίπεδα ΙκΒ-. Τα μη ανδρογονο-εξαρτώμενα κύτταρα παρουσίασαν την ακριβώς αντίστροφη εικόνα, δηλαδή αυξημένη δραστηριότητα 20S πρωτεασώματος και ενεργοποίηση του NF-κΒ μέσω της κανονικής οδού, και ελάχιστη δραστηριότητα ΝΕΡ με απότοκο ενισχυμένο νευροπεπτιδικό παρακρινές περιβάλλον.Στην συνέχεια της έρευνας αναλύθηκε η πιθανότητα ύπαρξης μιας δυναμικής σχέσης μεταξύ αυτών των οδών και οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Διέγερση με νευροπεπτίδια προκάλεσε ενεργοποίηση της οδού πρωτεασώματος/NF-κΒ (πυρηνική μετακίνηση NF-Β, άυξηση ποσού πυρηνικής πρωτεϊνης, αυξημένη σύνδεση NF-κΒ/DNA, μειωμένα κυτταρικά επίπεδα ΙκΒα), αυξημένη πρωτεασωμική δραστηριότητα, αλλά μόνο σε συνθήκες έλλειψης NEP. Επιπλέον, η ενεργοποίηση αυτή σαν αποτέλεσμα διέγερσης με νευροπεπτίδια δεν μπορούσε να επιτευχθεί αν προηγούνταν χρήση ειδικών νευροπεπτιδιακών αναστολέων ή αναστολέων της οδού πρωτεασώματος/NF-κΒ. Τέλος, η αύξηση της πρωτεσωμικής δραστηριότητας φαίνεται να είναι πρώιμο αποτελέσμα της νευροπεπτιδιακής διέγερσης, και έπεται η μείωση των κυτταρικών επιπέδων ΙκΒ- και η διέγερση του NF-κΒ.Τα αποτελέσματα μας φαίνεται ότι υποστηρίζουν την ύπαρξη μιας άμεσης μηχανιστικής σχέσης μεταξύ του άξονα ΝΕΡ/νευροπεπτιδίων και της οδού NFκΒ/πρωτεασώματος, με μια σαφή εικόνα εμπλοκής των νευροπεπτιδίων στην εξέλιξη προς την επιθετικότερη κατάσταση του μη-ανδρογονο-εξαρτώμενου καρκίνου προστάτη. ΟΙ σύγχρονες τάσεις στην αντινεοπλασματική θεραπεία υποστηρίζουν τις θεραπείες συνδυασμού για βέλτιστη αποδοτικότητα και εύρος αντικαρκινικής δράσης. Επομένως, η μεταφραστική έρευνα με στόχο την διευκρίνηση των μοριακών μηχανισμών που υπαγορεύουν την μετάβαση σε επιθετικότερους καρκινικούς φαινότυπους στοχεύει στην συνδυαστική κλινική εφαρμογή αγωνιστών/ανταγωνιστών. Τα δεδομένα της παρούσας ερευνητικής εργασίας υποδεικνύουν ότι τα νευροπεπτίδια επηρεάζουν την δραστηριότητα της οδού NFΒ/πρωτεασώματος. Ως εκ τούτου, θεραπεία συνδυασμού που θα στοχεύει και στις δύο οδούς μπορεί τελικά να αποδειχθεί ωφέλιμη στην κλινική πράξη, εμποδίζοντας αποτελεσματικότερα οδούς που έχουν γνωστή εμπλοκή στην επιβίωση, διήθηση και μετάσταση των προστατικών καρκινικών κυττάρων.