Κατιούσα επεξεργασία ενζύμων που αναγνωρίζουν νουκλεϊνικά οξέα

Abstract

In the present dissertation, the technology of synthetic combinatorial libraries was used for the purification of DNA recognizing enzymes. The design and the construction of the novel library was based on the "directed combinatorial method" making use of structural data of the protein-targets and application of molecular modeling of the synthetic ligands consisting the rational (focused) library. The affinity ligand design was based on mimicking the natural interactions between dNTPs and the B-motif, a conserved structural moiety found in Pol-I and Pol-II family of enzymes. The purification ability of the library was determined using biological extracts containing the protein-targets. Recognition elements of the ligands were used analogues of 9-aminoethyladenine and 9-aminoethylguanine mimicking the function of the natural bases adenine and guanine of the substrate. In addition, commercially available aromatic and aliphatic amino substances were also used, bearing a negative charged sulphonic or phosphonic moiety in order to mimic the phosphate group of the nucleotides. The resulting library was consisted of 26 mono- and di-substituted nucleotide-mimetic triazinyl ligands which were evaluated for their purification ability with three DNA recognizing enzymes: Pfu, Taq DNA polymerases and M-MLVH‾ reverse transcriptase. On the adsorbents which displayed the highest purifying ability and binding capacity of the above enzymes (specifically oABSAd for Ρfu DNA polymerase, mABSGu for Taq DNA polymerase and AEAd for M-MLVH‾ reverse transcriptase) a simplified purification protocol using low cost elution system was applied, leading in a single chromatography step to, high purity enzymes, with good recovery, suitable for experimental use.

Στην παρούσα διατριβή έγινε χρήση της τεχνολογίας των συνθετικών συνδυαστικών βιβλιοθηκών, για τον καθαρισμό ενζύμων που αναγνωρίζουν νουκλεϊνικά οξέα. Ο σχεδιασμός της πρωτότυπης βιβλιοθήκης βασίστηκε στην 'κατευθυνόμενη συνδυαστική μέθοδο', αξιοποιώντας δεδομένα της δομής των πρωτεϊνών-στόχων και εφαρμόζοντας μοριακή μοντελοποίηση των μορίων-δεσμευτών που αποτελούν την ορθολογική (εστιασμένη) βιβλιοθήκη. Ο σχεδιασμός της βιβλιοθήκης εστιάσθηκε στην λογική της μίμησης των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των dNTPs και του Β-μοτίβου, μια αυστηρά συντηρημένης περιοχής των Pol-Ι και Ρol-II οικογενειών των πολυμερασών, ενώ η πειραματική αξιολόγηση και τελική επιλογή έγινε με χρήση βιολογικών εκχυλισμάτων που περιείχαν τα ένζυμα-στόχους. Ως δεσμευτές (στοιχεία αναγνώρισης) χρησιμοποιήθηκαν παράγωγα των μορίων 9-αμινοαιθυλοαδενίνη και 9-αμινοαιθυλογουανίνη που μιμούνται τη λειτουργία των φυσικών βάσεων αδενίνη και γουανίνη του υποστρώματος και εμπορικά διαθέσιμες αρωματικές και αλειφατικές αμινο-ενώσεις που έφεραν αρνητική σουλφονική ή φωσφορική ομάδα προκειμένου να μιμούνται τη φωσφορική ομάδα των νουκλεοτίδιων. Η βιβλιοθήκη που προέκυψε περιείχε 26 μονοϋποκαταστημένους και διυποκαταστημένους νουκλεοτιδο-μιμητικούς τριαζινικούς δεσμευτές και αξιολογήθηκε για την ικανότητα καθαρισμού τριών ενζύμων που χρησίμευσαν ως πρότυπα: των Ρfu και Taq DNA πολυμερασών καθώς και της M-MLVH αντίστροφης τρανσκριπτάσης. Στους βέλτιστους προσροφητές που προέκυψαν από τη διαδικασία αξιολόγησης της ικανότητας καθαρισμού των ενζύμων (συγκεκριμένα ο oABSAd για την Pfu DNA πολυμεράση, ο mABSGu για την Taq DNA πολυμεράση και ο AEAd για την M-MLVH‾ αντίστροφη τρανσκριπτάση) έγινε εφαρμογή ενός απλού πρωτοκόλλου καθαρισμού εφαρμόζοντας έκλουση χαμηλού κόστους, οδηγώντας στην παρασκευή σε ένα χρωματογραφικό στάδιο, ενζύμων υψηλής καθαρότητας και σε καλή ανάκτηση, τα οποία πληρούσαν τις προϋποθέσεις για πειραματική χρήση.