Κλωνοποίηση και μελέτη της λειτουργίας του γονιδίου της ορμονοευαίσθητης λιπάσης (HSL) του προβάτου

Abstract

Hormone Sensitive Lipase (HSL) is a highly regulated enzyme that mediates lipolysis in adipocytes. HSL enzymatic activity is increased by adrenergic agonists, such as catecholamines and glucagons, which induce cyclic AMP (cAMP) intracellular production, subsequently followed by the activation ofProtein Kinase A (PKA) and its downstream signalling cascade reactions. Since HSL constitutes the key enzyme in the regulation of lipid stores and the only enzyme being subjected to hormonal regulation [in terms of the recently identified Adipose Triglyceride Lipase (ATGL)], the ovine Hormone Sensitive Lipase (ovHSL) full-length cDNA clones were isolated, using a Polymerase Chain Reaction-based (PCR) strategy. The two isolated isoforms ovHSL-A and ovHSL-B contain two highly homologous Open Reading Frame (ORF) regions of 2089 bp and 2086 bp, respectively, the latter having been missed the 688th triplet coding for glutamine (ΔQ⁶⁸⁸). The putative 695 and 694 amino acid respective sequences bear strong homologies with other HSL protein family members. Southern blotting analysis revealed that HSL is represented as a single copy gene in the ovine genome, while Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) approaches unambiguously dictated its variable transcriptional expression profile in the different tissues examined. Interestingly, as undoubtedly corroborated by both RTPCR and Western blotting analysis, ovHSL gene expression is notably enhanced in the adipose tissue during the fasting period, when lipolysis is highly increased in ruminant species. Based on the crystal structure of an Archaeoglobus fulgidus enzyme, a three-dimensional (3D) molecular model of the ovHSL putative catalytic domain was constructed, thus providing an inchoative insight into understanding the enzymatic activity and functional regulation mechanisms of the ruminant HSL gene product(s). In order to acquire detailed knowledge with regard to the mechanisms regulating ovine HSL gene transcription activity, we initially isolated and cloned the 5' proximal and distal promoter regions through a genome walking approach, with the utilization of the previously characterized ovHSL cDNAs. As evinced by BLAST analysis and a multiple alignment procedure, the isolated genomic fragment of 2744 bp appeared to contain the already specified 5'-untranslated region (5'-UTR), which was surprisingly interrupted by a relatively large intron of 1448 bp. Regarding the upstream remaining part of 1224 bp, it was demonstrated to represent a TATA-less promoter area, harboring several cfs-regulatory elements that could be putatively recognized by relatively more general transcription factors, mainly including Stimulating protein 1 (Sp1), CCAAT box Binding Factors (CBFs), Activator Protein 2 (AP2) and Glucocorticoid Receptor (GR), as well as other cis-acting regions denominated as Insulin Response Element (IRE), Glucose Response Element (GRE), Fat Specific Element (FSE) and cAMP Response Element (CRE), which could likely function in a condition-/hormone-dependent fashion. When different genomic fragments were directionally (5' to 3') cloned into a suitable reporter vector upstream of a promoter-less luciferase gene and transiently transfected into 3T3-L1 (mouse fibroblasts) as well as T24 (human bladder cancer) cell lines, strong promoter activities were unambiguously detected, with the -140/+18 nucleotide sequence bearing the highest transcriptional response, thus indicating that the 1224 bp 5' flanking region, isolated by genome walking, veritably contains the ovHSL gene promoter. Of particular significance are the observations that the functional promoter fragments could trigger the transcriptional activity of luciferase gene only under high concentration of glucose conditions in both cell lines, whereas the respective insulin responses seemed to follow a cell type-specific pattern.

Η ορμονοευαίσθητη λιπάση (Hormone Sensitive Lipase-HSL) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της λιπόλυσης στα αγροτικά ζώα (μηρυκαστικά, χοίρος), καθώς αποτελεί το ένζυμο-κλειδί, το οποίο βρίσκεται κάτω από ορμονικό έλεγχο, συμβάλλοντας καταλυτικά στη διάσπαση των τριγλυκεριδίων, της κύριας μορφής αποθήκευσης ενέργειας, προς διγλυκερίδια και απελευθέρωση λιπαρού οξέος. Η ορμονοευαίσθητη λιπάση ενεργοποιείται ύστερα από επίδραση στα κύτταρα του λιπώδους ιστού ορμονών, όπως η αδρεναλίνη και η γλυκαγόνη. Οι ορμόνες αυτές διεγείρουν κατάλληλους υποδοχείς, οι οποίοι ενεργοποιούν το ένζυμο αδενυλική κυκλάση (αδενυλοκυκλάση) της μεμβράνης των λιποκυττάρων. Η αυξημένη συγκέντρωση της κυκλικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης (cAMP) στη συνέχεια, διεγείρει την πρωτεϊνική κινάση Α, η οποία ενεργοποιεί μέσω φωσφορυλίωσης, τη λιπάση. Στόχο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η απομόνωση και ο μοριακός χαρακτηρισμός του γονιδίου που κωδικεύει την ορμονοευαίσθητη λιπάση στο πρόβατο. Η εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης οδήγησε στην απομόνωση του πλήρους μήκους cDNA που κωδικεύει την HSL. Συγκεκριμένα, απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν δύο κλώνοι-ισόμορφα ovHSL-A και ovHSL-B συνολικού μήκους 2248 bp και 2221 bp αντίστοιχα, που κωδικεύουν το συγκεκριμένο ένζυμο, διατηρώντας ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο 695 και 694 αμινοξέων, αντίστοιχα. Οι διαφορές των δύο κλώνων έγκεινται στην ύπαρξη ενός επιπλέον τρινουκλεοτιδίου στο ισόμορφο ovHSL-A που αντιστοιχεί στο αμινοξύ γλουταμίνη (Q), καθώς και στην επιπρόσθετη περιοχή μήκους 24 bp την οποία φέρει το ίδιο ισόμορφο και αποτελεί τμήμα της μη μεταφραζόμενης περιοχής (3' UTR) του γονιδίου. Στοίχιση της αμινοξικής αλληλουχίας των δύο κλώνων με τις αντίστοιχες αλληλουχίες των πρωτεϊνών άλλων θηλαστικών (άνθρωπος, ποντικός, αρουραίος, χοίρος, αγελάδα), έδειξε υψηλό ποσοστό συντήρησης. Παράλληλα, η προσπάθεια εύρεσης του αριθμού των αντιγράφων του υπό μελέτη γονιδίου, φανέρωσε ότι το συγκεκριμένο γονίδιο απαντά ως μοναδιαίο αντίγραφο (single copy gene) εντός του γονιδιώματος του προβάτου. Επιπλέον, μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου της ορμονοευαίσθητης λιπάσης σε διάφορους ιστούς προβάτου και βρέθηκε ότι το γονίδιο εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης στο λιπώδη ιστό, σε συνθήκες περιορισμένης διατροφής, περίοδος κατά την οποία η διαδικασία της λιπόλυσης είναι ιδιαίτερα αυξημένη. Το γονίδιο παρουσίασε παρόμοιο, χαμηλό πρότυπο έκφρασης στην περίπτωση των επινεφριδίων και των όρχεων, ενώ σημαντικά μειωμένο ήταν το επίπεδο έκφρασης στην περίπτωση των υπόλοιπων ιστών, παρουσιάζοντας μικρές διαφοροποιήσεις. Επομένως, η κατάσταση του υπό εξέταση οργανισμού και η επίδραση εξωγενών παραγόντων, όπως η διατροφή, αποτελούν καθοριστικούς παράγοντες με καταλυτική επίδραση στην έκφραση του γονιδίου της ορμονοευαίσθητης λιπάσης. Η εύρεση χαρακτηριστικών δομών και λειτουργικών περιοχών της πρωτεΐνης του υπό μελέτη γονιδίου, σύμφωνα με τα ήδη προσδιορισμένα πρωτεϊνικά μόρια άλλων οργανισμών, βοήθησε στην κατασκευή ενός τρισδιάστατου δομικού πρωτεϊνικού μοντέλου της ορμονοευαίσθητης λιπάσης. Το μοντέλο αποτελεί ένα αρχικό πρότυπο για την περαιτέρω ανάλυση των δομικών περιοχών και τη μελέτη δομικών αλλαγών από μελλοντικές μεταλλάξεις που πιθανόν να εντοπιστούν στην περιοχή του ενεργού κέντρου με επίπτωση στη λειτουργική δράση του ενζύμου. Πέραν των παραπάνω, μελετήθηκε η μεταγραφική ρύθμιση και έκφραση της λειτουργικής περιοχής του υποκινητή του γονιδίου της HSL. Η απομόνωση του υποκινητή πραγματοποιήθηκε με την τεχνική του χρωμοσωμικού βαδίσματος, απομονώνοντας εν τέλει περιοχή 1224 bp. Η in silico ανάλυση της περιοχής αυτής, ανέδειξε την παρουσία αρκετών θέσεων πιθανής πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων όπως είναι οι: Spi1(Stimulating protein 1), SRE (Sterol Regulatory Element), AP2 (Activator Protein 2), FSE (Fat Specific Element), GBP (G-Box Binding Proteins) CCAAT (cellular and viral CCAAT Box) ARE (Adipocyte Response Element), GR (Glucocorticoid Receptor), CRE (cAMP Response Element) IRE (Insulin Response Element), STRE (Stress Response Element), GRE (Glucose Response Element), SE (Steroidogenic Element), PRE (Preadipocyte Regulatory Element), GATA-1 (GATA Binding Factor 1), GATA-2 (GATA Binding Factor 2), PPRE (Peroxisome Proliferator-activated Receptor Element) και HSF (Heat Shock Factor), οι οποίοι εμπλέκονται στη μεταγραφική ρύθμιση του υπό μελέτη γονιδίου και κατ’ επέκταση στη ρύθμιση της διαδικασίας της λιπόλυσης. Η συγκριτική μελέτη των περιοχών του υποκινητή μεταξύ προβάτου και ανθρώπου, ως προς τους βασικούς μεταγραφικούς παράγοντες, κατέγραψε την παρουσία cis-λειτουργικών στοιχείων, αναδεικνύοντας ορισμένες διαφορές ως προς τον αριθμό και την ακριβή θέση που καταλαμβάνει ο εκάστοτε μεταγραφικός παράγοντας στην 5' ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου. Οι διαφορές αυτές εξασφαλίζουν, ταυτόχρονα, μια πρώτη εικόνα για τη μεταγραφική ρύθμιση και λειτουργία του συγκεκριμένου γονιδίου μεταξύ μηρυκαστικών και μονογαστρικών ειδών. Παράλληλα, η μελέτη της μεταγραφικής απόκρισης συγκεκριμένων cis-ρυθμιστικών περιοχών και λειτουργικών στοιχείων του υποκινητή του γονιδίου, με την παροδική διαμόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων και την επίδραση διαφορετικών «παραγόντων-φορέων», αποτελεί μια πρώτη προσέγγιση για τη ρύθμιση της λειτουργικότητας της ευρύτερης περιοχής του υποκινητή, αποσαφηνίζοντας τα όρια της «ελάχιστης» δομικά cis-ρυθμιστικής περιοχής που απαιτείται για την ελεγχόμενη γονιδιακή δραστηριότητα και καθορίζοντας τους μεταγραφικούς παράγοντες με καταλυτικό ρόλο στη μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου. Τέλος, η μελέτη τυχών παρατηρούμενων μεταλλάξεων στην περιοχή του υποκινητή, οι οποίες είναι άμεσα συνυφασμένες με παραγωγικές ιδιότητες του ζώου, όπως η εναπόθεση λίπους, ασκώντας επίδραση στη μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου, θα αποτελούσε έναν ενδιαφέρον τομέα έρευνας, καθορίζοντας νέους βελτιωτικούς στόχους για τη ζωική παραγωγή.