Ο ρόλος των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων των νουκλεοσωματικών ιστονών στην ενσωμάτωση της πρωτεΐνης HP1 στη χρωματίνη

Abstract

We have examined HP1-chromatin interactions in different molecular contexts in vitro and in vivo. Employing purified components we show that HP1 exhibits selective, stoichiometric, and salt-resistant binding to recombinant histone H3, associating primarily with the helical "histone fold" domain. Furthermore, using "bulk" nucleosomes released by MNase digestion, S-phase extracts, and fragments of peripheral heterochromatin, we demonstrate that HP1 associates more tightly with destabilized or disrupted nucleosomes (H3/H4 subcomplexes) than with intact particles. Western blotting and mass spectrometry data indicate that HP1-selected H3/H4 particles and subparticles possess a complex pattern of posttranslational modifications but are not particularly enriched in me₃K9-H3. Consistent with these results, mapping of HP1 and me₃K9-H3 sites in vivo reveals overlapping, yet spatially distinct patterns, while transient transfection assays with synchronized cells show that stable incorporation of HP1-gfp into heterochromatin requires passage through the S-phase. The data amassed challenge the dogma that me₃K9-H3 is necessary and sufficient for HP1 binding and unveil a new mode of HP 1-chromatin interactions. We have compared the distribution of the three HP1 variants (α, β and γ) in immortalized epithelial cells, embryonic stem cells and fibroblasts obtained from wild type or HP1-knockout animals. In parallel, we have interrogated assembly and dynamics of newly expressed HP1-gfp proteins under normal culture conditions and upon cell cycle arrest or treatment with HDAC or HAT inhibitors. The results reveal a range of cell type/state specific patterns that do not conform to the concept of a spatially fixed, me₃K9-histone H3-anchored protein network. Instead, our observations show that targeting of HP1 proteins to heterochromatin is regulated by both intrinsic and extrinsic factors, including HP1-HP1 interactions, cell cycle signals and developmental cues. These data provide new evidence for HP1 plasticity under shifting microenvironmental conditions and offer a concrete conceptual framework for understanding chromatin dynamics in vivo.

Εξετάσαμε τις αλληλεπιδράσεις της ΗΡ1 με τη χρωματίνη σε διαφορετικά επίπεδα πολυπλοκότητας σε in vivo και in vitro συνθήκες. Σε in vitro δοκιμές δείξαμε ότι η ΗΡ1 συνδέεται εκλεκτικά, στοιχειομετρικά και ανεξάρτητα από τις ιονικές συνθήκες στην ανασυνδυασμένη ιστόνη Η3, μέσω του κεντρικού τμήματος της ιστόνης («histone fold»). Επίσης χρησιμοποιώντας τεμάχια φυσικής χρωματίνης, χρωματίνη από κύτταρα συγχρονισμένα στη S-φάση, και περιφερική ετεροχρωματίνη δείξαμε ότι η ΗΡ1 συνδέεται πιο ισχυρά με αποσταθεροποιημένα και διασπασμένα (σωματίδια Η3/Η4) νουκλεοσώματα σε σχέση με τα ακέραια νουκλεοσώματα. Ακόμη με ανάλυση με ανοσοαποτύπωση κατά Western και με φασματοσκοπία μάζας δείξαμε ότι τα σωματίδια που επιλέγει η ΗΡ1 διαθέτουν ένα πολύπλοκο μοτίβο μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, δεν είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα σε me₃K9-H3 και δεν ακολουθούν το σύνολο των κανόνων που υπαγορεύονται από τον λεγόμενο ‘ιστονικό κώδικα’. Οι βιοχημικές παρατηρήσεις μας έδειξαν ότι η ΗΡ1 συνδέεται με τα διάφορα νουκλεοσωματικά υποστρώματα με τρόπο ο οποίος εξαρτάται από τη φυσική κατάσταση της χρωματίνης. Για τον λόγο αυτό, στη συνέχεια μελετήσαμε τη δυναμική οργάνωση της ΗΡ1 σε ένα κυτταρικό σύστημα, ώστε να συσχετίσουμε τις βιοχημικές παρατηρήσεις με διαδικασίες και λειτουργίες που λαμβάνουν χώρα υπό in vivo συνθήκες. Παρατηρήσαμε ότι η ΗΡ1 και η me₃K9-Η3 δεν συνεντοπίζονται απόλυτα και παρουσιάζουν διακριτά πρότυπα κατανομής, ενώ η σταθερή ενσωμάτωση της ΗΡ1 στις ετεροχρωματινικές εστίες εξαρτάται από την S φάση. Τα αποτελέσματα αυτά αμφισβητούν το δόγμα ότι η me₃K9-H3 αποτελεί τη μοναδική θέση πρόσδεσης για την ΗΡ1 και υποστηρίζουν ένα μηχανισμό ενσωμάτωσης που βασίζεται στην αντιγραφή. Επεκτείνοντας τη μελέτη, συγκρίναμε την κατανομή των τριών ισόμορφων της ΗΡ1 καθώς και την ενσωμάτωση και την δυναμική των HP1-GFP πρωτεϊνών σε διαφορετικά κυτταρικά συστήματα και μεταβολικές συνθήκες. Καταγράψαμε την παρουσία εναλλακτικών προτύπων κατανομής των πρωτεϊνών ΗΡ1 σε κύτταρα θηλαστικών που καθορίζονται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ΗΡ1 πρωτεϊνών, τον κυτταρικό κύκλο και το αναπτυξιακό δυναμικό των κυττάρων, ανεξάρτητα από τη παρουσία της me₃K9-H3.