Βελτιστοποίηση των δυνατοτήτων αξιοποίησης του σπέρματος κριού μετά από τον εμπλουτισμό του σε ζωηρά κινούμενα σπερματοζωάρια

Abstract

Ram semen processing laboratories are sometimes confronted with the need to use semen of high genetic merit rams with relatively low semen quality. Thus, any method that would increase sperm viability in low viability ejaculates could be useful. In this study the possibility of a glass beads filtration method by estimating the beads Total Surface Provided (TSP) for adhesion of spermatozoa, was evaluated. Initially, two different TSP (102cm2 and 154cm2) achieved by various sizes of beads (1500, 2000 και 3000 μm in diameter) were tested. No significant difference in sperm viability improvement was noticed for the same TSP by different beads (P>0.05). Optimization tests were then performed in which three different funnels were used for filtration at a standard TSP (154 cm2). The pear shaped funnel was found to be the most appropriate for filtration, since semen volume recovery and sperm viability improvement were more pronounced (P<0.05). Subsequently, filtration tests were performed with pear shaped funnels with different TSP (102cm2 and 154cm2) obtained by the aforementioned beads sizes (1500, 2000 and 3000 μm) in equal aliquots. TSP of 102 cm2 proved to be most appropriate for filtration, as shown by the significant improvement of sperm viability (P<0.05) and the significantly higher filtrate semen volume (P<0.05). The optimum TSP of 102 cm2 was then used for the filtration of rejected low viability ejaculates for 12 months. Ejaculate characteristics (viability, volume, sperm concentration) were recorded both before και after filtration. The filtration procedure recovered 88.25% of the live sperm population along with 48.3% of the dead sperm population. Viability of the filtrated samples was improved more than 23% of its initial value, volume recovery exceeded 65% και sperm concentration was not in any way affected by the filtration procedure. Filtration time was less than 3 minutes (151 seconds in average). Filtrated samples and untreated samples were diluted, packaged in 0.25 ml straws and stored (5o C) for 72 hours. Spermatozoal characteristics (viability, acrosomal status, HOS test, production of ROS, sperm kinematics) of both the filtrated and untreated samples were recorded every 24 hours within the storage period. Viability of the filtrated samples was significantly higher than the untreated samples in 0, 24, 48 and 72 hours (P<0.05). The acrosomal status of the filtrated spermatozoa was no different than that of untreated spermatozoa in 0, 24, 48 and 72 hours (P>0.05). Filtrated spermatozoa were more resistant to the HOS test than the untreated samples in 0, 24, 48 and 72 hours (P<0.05). Significant difference between groups in ROS production was detected after 72 hours of storage (P<0.05). Analysis of the results revealed that the efficiency of the filtration procedure is increased in the breeding season of rams. Estimation of the reproductive value of the filtrated samples using the Fucntional Sperm Fraction (F.S.F.) index system revealed that the filtrated samples can be used for AI up to 24 hours after their filtration within the breeding season. In conclusion, ram sperm viability improvement by more than 20% of its initial value και semen volume recovery by more than 60%, along with the fact that the total filtration time did not exceed three minutes in any case, suggest that through further development this method could be successfully used during ram semen processing.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διεύρυνση της δυνατότητας αξιοποίησης υποβαθμισμένων εκσπερματισμάτων κριών (με ζωτικότητα <70%) που κατά κανόνα απορρίπτονται ως ακατάλληλα. Η βελτίωση της αναλογίας του εκσπερματίσματος σε ζωηρά κινούμενα σπερματοζωάρια (εμπλουτισμός) επιχειρείται με τη χρήση φίλτρου γυάλινων σφαιριδίων κατακράτησης των νεκρών σπερματοζωαρίων. Καθοριστικός παράγοντας για τη διαμόρφωση του φίλτρου θεωρείται η Συνολική Προσφερόμενη Επιφάνεια των Σφαιριδίων (Σ.Π.Ε.), ανεξάρτητα από το μέγεθός τους. Η πειραματική ομάδα συγκροτήθηκε από τους είκοσι επτά (27) σπερματοδότες κριούς φυλής Χίου του Ι.Α.Τ.Σ. Τα ζώα, ηλικίας 2-6 ετών στεγάζονταν και διατρέφονταν κάτω από τις ίδιες συνθήκες σε όλη της διάρκεια του πειραματισμού. Χρησιμοποιήθηκαν τα εκσπερματίσματα που απορρίπτονταν ως ακατάλληλα για περαιτέρω επεξεργασία από το Ι.Α.Τ.Σ. λόγω χαμηλής ζωτικότητας [<70%, υποκειμενική εκτίμηση σε οπτικό μικροσκόπιο NIKON Eclipse E200 (100x)], αλλά με κινητικότητα >3,5 [υποκειμενική εκτίμηση σε οπτικό μικροσκόπιο NIKON Eclipse E200 (100x)] και πυκνότητα >2.600x106 σπερματοζωαρίων/ml (μέτρηση με την βοήθεια πυκνόμετρου DR LANGE LP1). Σε κάθε επιμέρους πειραματισμό τα επιλεχθέντα εκσπερματίσματα αναμιγνύονταν μεταξύ τους (pooling). Ακολουθούσε επαναξιολόγηση της ζωτικότητας, της κινητικότητας και της πυκνότητας του ενιαίου δείγματος. Στη συνέχεια, το δείγμα διαχωριζόταν σε ίσα μέρη όγκου 3 ml. Ακολουθούσε η διαδικασία ανάμιξης του κάθε δείγματος των 3 ml με προεπιλεγμένη ποσότητα γυάλινων σφαιριδίων (Worf Glasskugeln GmBh, Meinz Germany), διαμέτρου 1.500, 2.000 ή 3.000 μm, με συγκεκριμένη συνολική επιφάνεια. Στη διάρκεια όλων των χειρισμών τα εκσπερματίσματα/δείγματα διατηρούνταν σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37οC. Ο προσδιορισμός της Σ.Π.Ε. μιας δεδομένης ποσότητας σφαιριδίων συγκεκριμένης διαμέτρου (απαραίτητη για την διεξαγωγή των πειραματισμών) έγινε με τη χρήση της ‘αρχής της Άνωσης’ του Αρχιμήδη. Αρχικά, για τον έλεγχο της ακρίβειας της υπόθεσης ότι η Σ.Π.Ε. είναι το καθοριστικό μέγεθος διαμόρφωσης του φίλτρου σφαιριδίων, ως συσκευή υποδοχής του μίγματος σφαιριδίων/εκσπερματίσματος χρησιμοποιήθηκε μια απλή χοάνη με την προσθήκη ενός γυάλινου σφαιριδίου διαμέτρου 5 mm στο στόμιό της για τον έλεγχο της ροής και τη συγκράτηση του φίλτρου. Σε όλα τα δείγματα που ήλθαν σε επαφή με Σ.Π.Ε. ίσης έκτασης παρατηρήθηκε σημαντική βελτίωση της ζωτικότητας ανεξάρτητα από τη διάμετρο των σφαιριδίων που χρησιμοποιήθηκαν (P<0,05). Για την αξιολόγηση της χρησιμότητας της προηγούμενης ανάμειξης του μίγματος σφαιριδίων εκσπερματίσματος χρησιμοποιήθηκαν φίλτρα Σ.Π.Ε. 51 cm2. Από τα αποτελέσματα καταγράφηκε σημαντική βελτίωση της ζωτικότητας του εκσπερματίσματος (Ρ<0,05) και στις δύο ομάδες (ανάμιξη ή μη) αλλά η βελτίωση στην ομάδα της ανάμειξης ήταν σημαντικά μεγαλύτερη (Ρ<0,05).