Ανάπτυξη μοριακών διαγνωστικών μεθόδων για την αναγνώριση μολυσματικών φύλων φουζαριού και μελέτη αλληλεπιδράσεων με φυτά

Abstract

Cotton fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (FOV), is considered as a major threat for commercial cotton production worldwide due to its devastating effect on the vascular system of cotton plants and its ability to survive in water, seeds or soil for very long periods. Therefore accurate characterization and sensitive detection in potential contamination sources of these pathogenic FOV isolates are prerequisites for the application of a prevention program and for the developing of key strategies in disease management. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of the repetitive regions of the ribosomal intergenic spacer regions (IGS) and digestion with three restriction enzymes (AluI, HaeIIIII, RsaI) resulted in three unique restriction profiles (IGS haplotypes 1,2,3) for Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum isolates, capable of distinguishing them from other formae speciales of Fusarium oxysporum. In addition, a portion of the IGS region flanking the 5’ end was sequenced and single nucleotide polymorphisms (SNPs) were revealed. Using these data there were developed two specific Real Time PCR-based assays for the absolute quantification of genomic DNA from these isolates in soil substrates and infected cotton tissues. Standard curves showed a linear relation (r2=0.99) between log values of fungal genomic DNA and Real Time PCR threshold cycles. The detection sensitivity when inoculums were added to sterile soils was in some cases lower than 104 conidia·g-1 soil tested. Furthermore in order to identify possible involvement of salicylic acid (SA)- or jasmonate (JA)- dependent signal transduction pathways in defense mechanisms against the aforementioned fungus, we examined the effect of treatment of cotton plants (resistant and susceptible cultivars) with chemical inducers such as BION (a chemical analogue of SA) and methyl jasmonate (MeJA) before challenge with a pathogenic isolate of this fungus. The cotton pathogenesis-related (PR) genes examined were PR10 and chitinase (PR3) for which plylogenetic analysis showed low degree of homology with other similar function genes. Expression changes of these genes in roots and hypocotyls (of a susceptible variety, LACTA and of a resistant one, EMERALD) by Real Time PCR provided useful data of defense reactions on this type of plant-pathogen interaction. It was observed a high induction of expression of chitinase gene in hypocotyls and roots of the susceptible variety after treatment with MeJA, while in PR10 was rapidly induced in both tissues of the same variety after treatment with BION. Finally, in contrast to the hypocotyls of susceptible variety, the hypocotyls of the resistant variety over expressed both genes after simple infection with Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum isolate.

Η φουζαρίωση του βάμβακος που προκαλείται από τον μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (FOV) θεωρείται κύρια απειλή για την καλλιέργεια βάμβακος παγκοσμίως εξαιτίας των καταστρεπτικών συνεπειών που προκαλεί μέσω του αποικισμού του παθογόνου στις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες των φυτών και της ικανότητας του να επιβιώνει για μεγάλες χρονικές περιόδους στο νερό, τους σπόρους και στο έδαφος. Επομένως, είναι αναγκαίος ο χαρακτηρισμός και η αξιόπιστη μοριακή ανίχνευση αυτών των απομονώσεων του FOV σε πιθανές πηγές μόλυνσης καθώς αποτελούν απαραίτητες προϋποθέσεις για την εφαρμογή προγραμμάτων φυτοπροστασίας. Η ενίσχυση με αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) των επαναλαμβανόμενων τμημάτων των ριβοσωμικών ενδογονιδιακών περιοχών (IGS) και κοπή με τρία περιοριστικά ένζυμα (AluI, HaeIIIII, RsaI) είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία τριών ευδιάκριτων προτύπων (IGS απλότυποι 1,2,3) για αυτές τις απομονώσεις του Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, ικανές να τις διαχωρίζουν από άλλες ειδικές μορφές (formae speciales) του Fusarium oxysporum. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση των τμημάτων που συνορεύουν με το 5΄ άκρο των περιοχών αυτών και εντοπίστηκαν πολυμορφισμοί απλού νουκλεοτιδίου (SNPs). Χρησιμοποιώντας αυτά τα δεδομένα αναπτύχθηκαν δυο εξειδικευμένες δοκιμές PCR πραγματικού χρόνου για την απόλυτη ποσοτικοποίηση του γενωμικού DNA αυτών των απομονώσεων σε διάφορα εδάφη και φυτικούς ιστούς επιμολυσμένων φυτών. Τα πρότυπα διαγράμματα αναφοράς κατέδειξαν γραμμικές συσχετίσεις (r2=0.99) μεταξύ του λογάριθμου της ποσότητας του γενωμικού DNA και των κύκλων ανίχνευσης της PCR πραγματικού χρόνου. Η ευαισθησία ανίχνευσης όταν μολύνθηκαν τα εδάφη ήταν σε κάποιες περιπτώσεις λιγότερο από 104 κονίδια·g-1 εδάφους. Επιπλέον, με σκοπό να αναγνωριστεί η πιθανή ανάμειξη των εξαρτώμενων από το σαλικυλικό (SA) ή το ιασμονικό οξύ (JA) βιοχημικών οδών μεταγωγής σήματος στην ενεργοποίηση των αντιδράσεων άμυνας έναντι αυτών των απομονώσεων, εξετάστηκε η επίδραση της επέμβασης σε φυτά βαμβακιού (ευπαθούς και ανθεκτικής ποικιλίας) χημικών επαγωγέων όπως το ΒΙΟΝ (ένα ανάλογο του SA) και του μεθυλεστέρα του ιασμονικού οξέος (MeJA) πριν την μυκητολογική πρoσβολή με μια μολυσματική απομόνωση του μύκητα αυτού. Τα γονίδια του βάμβακος που εξετάστηκαν και σχετίζονται με την παθογένεση (PR γονίδια) ήταν αυτά του PR-10 (δράση ριβονουκλεάσης) και της χητινάσης (PR-3) και για τα οποία η φυλογενετική ανάλυση έδειξε χαμηλό βαθμό ομολογίας με άλλες παρόμοιες πρωτεΐνες. Η μελέτη των επαγόμενων αλλαγών σχετικής έκφρασης αυτών των δυο γονιδίων με PCR πραγματικού χρόνου στις ρίζες και στα υποκότυλα (μιας ευπαθούς ποικιλίας, της LACTA και μιας ανθεκτικής, της EMERALD) παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για τις αντιδράσεις άμυνας σε αυτού του είδους τις αλληλεπιδράσεις φυτού-παθογόνου. Σημαντική επαγωγή της έκφρασης της χητινάσης στα υποκότυλα και τις ρίζες της ευπαθούς ποικιλίας παρατηρήθηκε ύστερα από επέμβαση με MeJA, ενώ τα επίπεδα των μεταγράφων του PR10 αυξήθηκαν πολύ πιο ραγδαία και στους δυο ιστούς της ίδιας ποικιλίας ύστερα από επέμβαση με ΒΙΟΝ. Σε αντίθεση με τα υποκότυλα της ευπαθούς ποικιλίας στην ανθεκτική τα επίπεδα έκφρασης και των δυο γονιδίων αυξήθηκαν ύστερα από μόλυνση με τη μολυσματική απομόνωση.