Μελέτη διαλογής (triage) με βάση την πρωτεϊνική υπογραφή της λοίμωξης από τον ιό HPV σε δείγματα κυτταρολογίας υγρής φάσης γυναικών στον Ελλαδικό χώρο και σύγκριση των αποτελεσμάτων με σκοπό την εναρμόνιση του πληθυσμιακού ελέγχου με τις διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες

Abstract

Introduction: Cervical cancer (CxCa), although preventable, remains a global health problem despite the availability of effective screening methods. The World Health Organization in 2020 announced the strategy to eliminate cervical cancer by 2030 based on three targets. Specifically, vaccinating 90% of young girls, screening 70% of eligible women twice in their lifetime, and treating 90% of precancerous lesions or invasive cancer.For decades, regular Pap smear testing has contributed to substantial reductions in Cervical Cancer morbidity and mortality. On the other hand, the causal relationship between the infection with high-risk type of human papillomavirus (HR-HPV) and the development of cervical cancer has led to the introduction of HPV testing into organized population control programs. However, it is a fact that it is impossible and at the same time ineffective to refer all HPV positive women to colposcopy, as a high percentage of HPV infections will regress spontaneously. Therefore, it is imperative to find suitable screening tests for the early detection of HR-HPV positive women who have an increased likelihood of developing cervical high-grade lesions or CxCa. In search of an objective biomarker with high clinical performance, evidence in the recent literature has showed that dual immunocytochemical staining (p16/Ki-67 dual-stain) may be a reliable triage screening test. Aim: The present doctoral thesis aimed to initially evaluate the diagnostic accuracy ofp16/Ki-67 dual-stain, as a triage method for detecting underlying cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or worse (CIN2+). In addition, the suitability of the biomarker as a triage test was investigated in existing primary screening strategies for the most effective management of women with mild and equivocal cytological findings or HR-HPV positive. Materials and Method: According to the study design, women aged 20 to 60 years old who proceeded to the Clinic of Cervical Pathology and Colposcopy of the General Hospital of Athens «Alexandra», for their annual cytology-based primary screening examination, were recruited. The final study cohort comprised of 759 cases with negative, equivocal, or low-grade cytological findings. Each liquid-based cytology sample was tested for HPV DNA detection and dual-stained cytology (p16/Ki-67 dual-stain). Patients were subsequently referred to colposcopy with cervical biopsy for histological diagnosis. Women with CIN2+ histologic evaluations were managed accordingly to their individual medical history and the national guidelines while patients with negative results or <CIN2 histological confirmations were referred for routine screening. Results: The main findings of the study were the following: regarding the prevalence of high-risk (HR-HPV) types of the virus in the study population, HPV16 was the predominant genotype with a prevalence of 17.4%, followed by HPV31 and HPV51 (9.9% and 7.6%, respectively). Infection by HPV18 and HPV16 has been a stronger risk factor for the development of CIN2+ lesions with OR: 53.16 and OR: 11.31, respectively compared to the other HR-HPV types. HR-HPV and p16/Ki-67 dual-stain positivity rates increased with histopathological lesions severity. Specifically, HR-HPV rates increased as dysplasia deteriorated from 37.6% in No CIN, to 62.5% in CIN1 cases through 98.7% in CIN2+ lesions. In addition, dual stain cytology rates were higher from 0% in No CIN, to 1.6% in CIN1 through 97.3% in CIN2+ histological evaluations. Concerning the clinical efficiency analysis of the diagnostic methods our findings, similar to other published studies, illustrated that both p16/Ki-67 dual-stained cytology and HR-HPV test presented similar high sensitivity of 97.3% and 98.7%, respectively. However, p16/Ki-67 dual-stain provided higher specificity values of 99.3% superior to that of the HR-HPV test (52.2%,) with statistical significance (p <0.005). Furthermore, considering the ASCCP primary screening guidelines of referring for colposcopy women tested positive for HPV16/18 or for the rest 12 HR-HPV types with positive cytology results of ASCUS or higher, we studied and evaluated different screening scenarios according to colposcopy referrals. Concerning the population of the study, the ASCCP algorithm would require 352 colposcopies to detect 147 out of 149 actual CIN2+ cases (2.4 colposcopies/CIN2+ case). Interestingly, the implementation of p16/Ki-67 dual-stain as a triage method in the ASCCP guideline as well as in different existing screening strategies has led to a decrease in the number of colposcopies to detect CIN2+ cases, resulting in a ratio of 1.0 colposcopy needed per CIN2+ incident. Conclusions: As a conclusion, the results of this doctoral thesis demonstrate the clinical utility of p16/Ki-67 dual-stained cytology as a triage method for the effective management of women with mild cervical abnormalities. p16/Ki-67 dual-stain in accordance with other studies is an objective biomarker with equal high sensitivity and significantly higher specificity versus HR-HPV test for CIN2+ detection. In addition, the findings support the use of dual stained cytology as a triage test in existing screening strategies by minimizing references for colposcopy. Especially in countries, such as Greece, with mainly opportunistic screening, based on cytological examination, the implementation of p16/Ki-67 dual-stain, could provide accuracy and financial benefits for the healthcare system.

Εισαγωγή: Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας (CxCa) μπορεί να προληφθεί εγκαίρως. Όμως παραμένει μέχρι και σήμερα παγκόσμιο πρόβλημα υγείας πάρα την διαθεσιμότητα σύγχρονων και αποτελεσματικών μεθόδων προσυμπτωματικού ελέγχου. Το 2020 ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας ανακοίνωσε την προοπτική εξάλειψης του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας έως το 2030 μέσω μίας στρατηγικής βασισμένης σε τρείς πυλώνες και συγκεκριμένα, τον εμβολιασμό του 90% των κοριτσιών νεαρής ηλικίας, τον έλεγχο του 70% των γυναικών δύο φορές κατά τη διάρκεια της ζωής τους και την αντιμετώπιση του 90% των προκαρκινικών αλλοιώσεων και του διηθητικού καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Για δεκαετίες, ο τακτικός ετήσιος έλεγχος με το τεστ Παπανικολάου έχει συμβάλει στη μείωση της νοσηρότητας και θνησιμότητας από τον CxCa. Από την άλλη, η αιτιολογική σχέση μεταξύ της μόλυνσης με υψηλού κινδύνου τύπους του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HR-HPV) και της ανάπτυξης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας οδήγησε στην εισαγωγή του HPV τεστ σε οργανωμένα συστήματα πληθυσμιακού ελέγχου. Ωστόσο είναι γεγονός πως είναι ανέφικτο και ταυτόχρονα αναποτελεσματικό να παραπέμπονται σε κολποσκόπηση όλες οι γυναίκες με θετικό HPV αποτέλεσμα, καθώς ένα υψηλό ποσοστό των HPV λοιμώξεων υποστρέφουν. Επομένως, αποτελεί επιτακτική ανάγκη η ανεύρεση κατάλληλων τεστ διαλογής για την έγκαιρη ανίχνευση των HR-HPV θετικών γυναικών που παρουσιάζουν αυξημένη πιθανότητα ανάπτυξης υψηλόβαθμων αλλοιώσεων στον τράχηλο ή και καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Σε αναζήτηση μιας αντικειμενικής μεθόδου διαλογής με υψηλή κλινική απόδοση, η διπλή ανοσοκυτταροχημική χρώση (p16/Ki-67 dual-stain) έχει αναφερθεί ως αξιόπιστο τεστ διαλογής στην πρόσφατη διεθνή βιβλιογραφία. Σκοπός: Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο αρχικά την αξιολόγηση της διαγνωστικής ακρίβειας του βιοδείκτη της διπλής ανοσοκυτταροχημικής χρώσης, p16/Ki-67 dual-stain, για την ανίχνευση υποκείμενης τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας CIN2 και άνω (CIN2+). Επιπλέον, διερευνήθηκε η καταλληλότητα του βιοδείκτη ως τεστ διαλογής σε υπάρχουσες στρατηγικές προσυμπτωματικού ελέγχου για την αποτελεσματικότερη διαχείριση των γυναικών με ήπιες και χαμηλού βαθμού τραχηλικές αλλοιώσεις ή άνευ αλλοιώσεων αλλά με θετικό αποτέλεσμα σε υψηλού κινδύνου τύπο HPV. Υλικά και Μέθοδος: Για τη μελέτη στρατολογήθηκαν γυναίκες 20 έως 60 ετών οι οποίες παρακολουθούντο στο ιατρείο Παθολογίας Τραχήλου και Κολποσκόπησης του Γενικού Νοσοκομείου «Αλεξάνδρα». Ο πληθυσμός της μελέτης αφορούσε 759 περιστατικά με αρνητικά, οριακά ή χαμηλού βαθμού κυτταρολογικά ευρήματα. Σε όλα τα δείγματα υγρής κυτταρολογίας διενεργήθηκε ανίχνευση HPV DNA και εφαρμογή της κυτταρολογίας διπλής χρώσης (p16/Ki-67 dual-stain). Εν συνεχεία, οι ασθενείς παραπέμφθηκαν σε κολποσκόπηση και λήψη βιοψίας για ιστολογική διάγνωση. Στις γυναίκες με ιστολογικά ευρήματα CIN2+ συστήθηκε άμεση αντιμετώπιση ανάλογα με το ατομικό ιατρικό ιστορικό και τις εθνικές κατευθυντήριες οδηγίες ενώ οι ασθενείς με αρνητικά αποτελέσματα ή ιστολογικές διαγνώσεις <CIN2 παραπέμφθηκαν για έλεγχο ρουτίνας. Αποτελέσματα: Αναφορικά με τον επιπολασμό των υψηλού κινδύνου (HR-HPV) τύπων του ιού στον πληθυσμό της μελέτης ο HPV16 ήταν ο επικρατέστερος γονότυπος με συχνότητα 17,4%, ακολουθούμενος από τους HPV31 και HPV51 (9,9% και 7,6%, αντίστοιχα). Η λοίμωξη από τους HPV18 και HPV16 αποτέλεσε ισχυρότερο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη CIN2+ αλλοιώσεων με OR: 53,16 και OR: 11,31 σε σύγκριση με τους υπόλοιπους HR-HPV τύπους. Η θετικότητα των περιστατικών για τους HR-HPV τύπους και για τη διπλή χρώση (p16/Ki-67 dual-stain) συσχετίστηκε σημαντικά με τη βαρύτητα της ιστοπαθολογικής διάγνωσης. Συγκεκριμένα, τα HR-HPV ποσοστά θετικότητας αυξήθηκαν καθώς η δυσπλασία επιδεινώθηκε από 37,6% σε φυσιολογικά, 62,5% σε CIN1 και 98,7% σε CIN2+ περιστατικά. Επιπλέον, τα ποσοστά θετικότητας για τη p16/Ki-67 dual-stain αυξήθηκαν από 0% στα φυσιολογικά, 1,6% σε CIN1 και σε 97,3% για CIN2+ περιστατικά. Η αξιολόγηση της κλινικής απόδοσης των δοκιμασιών στο συνολικό πληθυσμό της μελέτης έδειξε ότι τόσο η p16/Ki-67 dual-stain όσο και το HR-HPV τεστ παρουσίαζαν παρόμοια υψηλή ευαισθησία (97,3%) και (98,7%), αντίστοιχα. Ωστόσο, η p16/Ki-67 dual-stain παρείχε υψηλότερη ειδικότητα στο 99,3% σε σύγκριση με το HR-HPV τεστ (52,2%), με στατιστική σημαντικότητα (p<0,005). Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψη τις κατευθυντήριες οδηγίες προσυμπτωματικού ελέγχου της ASCCP σύμφωνα με τις οποίες οι γυναίκες που ανευρίσκονται θετικές για τους HPV16/18 ή για τους υπόλοιπους 12HR-HPV τύπους με θετικά κυτταρολογικά ευρήματα ASCUS και άνω θα πρέπει να παραπέμπονται σε κολποσκόπηση, μελετήσαμε και αξιολογήσαμε διαφορετικά σενάρια προσυμπτωματικού ελέγχου σύμφωνα με τις παραπομπές για κολποσκόπηση. Όσον αφορά τον πληθυσμό της μελέτης, ο ASCCP αλγόριθμος θα απαιτούσε 352 κολποσκοπήσεις για τον εντοπισμό 147 από τις 149 CIN2+ περιπτώσεις (2,4 κολποσκοπήσεις/περίπτωση CIN2+). Είναι ενδιαφέρον ότι η εφαρμογή της p16/Ki-67 dual-stain ως μεθόδου διαλογής στις περιπτώσεις της μελέτης μας, οδήγησε σε μείωση του αριθμού των κολποσκοπήσεων για την ανίχνευση CIN2+ αλλοιώσεων σε μόλις 1,0 κολποσκόπηση ανά CIN2+ περιστατικό. Συμπεράσματα: Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτής της διδακτορικής διατριβής καταδεικνύουν την κλινική χρησιμότητα της p16/Ki-67 dual-stain ως μεθόδου διαλογής για την αποτελεσματική διαχείριση γυναικών με ήπιες αλλοιώσεις του τραχήλου της μήτρας. Η p16/Ki-67 dual-stain, σύμφωνα και με άλλες μελέτες στη διεθνή βιβλιογραφία, αποτελεί έναν αντικειμενικό βιοδείκτη με εξίσου υψηλή ευαισθησία και σημαντικά υψηλότερη ειδικότητα έναντι της HR-HPV δοκιμής για ανίχνευση CIN2+ αλλοιώσεων. Επιπλέον, τα ευρήματα υποστηρίζουν τη χρήση της διπλής χρώσης ως δοκιμή διαλογής σε υπάρχουσες στρατηγικές προσυμπτωματικού ελέγχου ελαχιστοποιώντας τις αναφορές για κολποσκόπηση. Ειδικά σε χώρες, όπως η Ελλάδα, με κατά κύριο λόγο ευκαιριακό προσυμπτωματικό έλεγχο, βασιζόμενο στην κυτταρολογική εξέταση, η εφαρμογή της p16/Ki-67 dual-stain θα μπορούσε να προσφέρει αντικειμενικότητα και οικονομικά οφέλη για το σύστημα υγειονομικής περίθαλψης.