Μοριακή χαρτογράφηση της μετάθεσης t(14;18) στα κακοήθη λεμφώματα

Abstract

The progress of cancer genetics research bas brought into light specific genetic alterations that characterize certain types of leukemias and lymphomas. These alterations are chromosomal translocations (t(8;14) in Burkitt lymphoma, t(11;14) in chronic lymphocytic leukemia and t(14;18) in follicular lymphomas) considered to actively participate in lymphomagenesis. The chromosomal breakpoints of these translocations became,- during the last decade, the object of thorough molecular research, that was based on the hypothesis that deregulation of very important genes located at these breakpoints should underly the development of cancer. The hypothesis was justified by the identification of the already known c-myc oncogene at the 8q24 breakpoint of Burkitt t(8;14), an oncogene especially involved in cell proliferation and differentiation. It was also found that the translocation brings c-myc into the Immunoglobulin Heavy Chain (IgH) gene, specifically related to the function of B-lymphocytes that typically consist the origin of Burkitt lymphoma. This amazing discovery was soon followed by the description of the molecular basis of t(14;18), characteristic of follicular lymphomas, a B-lymphocyte originating neoplasm. The IgH gene participates in this translocation along with a new gene that was characterized as oncogene, since it is strongly correlated with this type of lymphoma. Finally, bcl-1 was found participating in t(11;14) of chronic lymphocytic leukemia, as does again the IgH gene. All the findings mentioned above supported the hypothesis that the chromosomal alterations characterizing these neoplasms consist their genetic basis, probably involved in their pathogenesis. The question that followed these discoveries was naturally concerning the mechanism that results in the deregulation of the oncogenes involved in these translocations. t(8;14) was the first to be studied, proving that the truncation of c-myc and its relocation into the IgH gene places it under the influence of the strong IgH enhancer, leading to its upregulated function. At the same time, it is well known that c-myc is transcribed, for a very brief period of time, when the cell, stimulated by a mitogenic factor, is getting ready to divide. It is easy, based on these data, to correlate the continuous transcription of c-myc with the development of a neoplastic population which, by definition, is characterized by continuous proliferation of the cells that consist it. The molecular studies of t(14;18) were based on the same as t(8;14) prototype. In this case also, was shown that bcl-2 oncogene is normally transcribed only when the B-lymphocyte receives an antigenic Stimulus, and discontinues transcribing after it has recruited the cell into cell cycle. The upregulation of bcl-2, in contrast to c-myc is difficult to explain, since the breakpoints in bel-2 that have been described (MBR major breakpoint region and MCR minor cluster region), are far away from the IgH enhancer, located in nonfunctional areas of the gene. The aim of this study was to thoroughly map bcl-2 in a large series of follicular lymphomas, in order to establish the frequency of MBR and MCR implication in t(14;18). The IgH gene was also studied. We studied 52 follicular lymphomas that consist the largest series in the literature. In 43 of these cases, there also was karyotypic analysis. DNA was isolated from biopsy tissues and it was studied by sequential hybridizations with 5 probes (3 for MBR, 2 for IgH). The DNA in all cases had been treated with 4 restriction enzymes, prior to hybridization. Bcl-2 was found rearranged in 37 (71%) of the cases. 5/6 cases with normal karyotype are also included, proving the increased sensitivity of the molecular method for the identification of t(14;18). The frequency of breakpoints implication was: MBR 81%, MCR 16%, while only in one case bcl-2 presented a breakpoint in 5' region. The most interesting finding of this study was the identification for the first time in the literature, of an additional abnormality in the 5' region of bcl-2, in 7 cases, along with the major break of the gene (MBR in 6 cases, MCR in 1). We estimated that this additional abnormality was either a small deletion or a point mutation and we consider it very important because of its location in the 5' region, the site of all sequences that regulate the transcription of the gene. We express the hypothesis that this small abnormality may prove to be involved in the deregulation of bcl-2 and the development of this type of lymphoma that bears it.

Η πρόοδος που σημειώθηκε στην γενετική του καρκίνου τις τελευταίες δεκαετίες, έφερε στο φώς συγκεκριμένες αλλοιώσεις της γενετικής δομής των λεμφωμάτων και λευχαιμιών. Οι κακοήθειες αυτές του λεμφικού ιστού βρέθηκαν ότι χαρακτηρίζονται από ειδικές χρωμοσωμιακές μεταθέσεις: στο λέμφωμα Burkitt παρατηρείται η t(8;14), στην χρόνια λεμφογενή λευχαιμία η t(11;14) και στο οζώδες λέμφωμα η t(14;18). Εύλογα συνδέθηκε η ύπαρξη αυτών των σταθερών και συχνών βλαβών με την παθογένεση των αντιστοίχων νεοπλασμάτων. Τα σημεία θραύσης (breakpoints) των χρωμοσωμάτων που συμμετέχουν στις μεταθέσεις αυτές έγιναν αντικείμενο εντατικής σε μοριακό επίπεδο έρευνας. Την έρευνα αυτή καθοδηγούσε η υπόθεση ότι στα σημεία αυτά θα πρέπει να υπάρχουν γόνοι οι οποίοι απορρυθμιζόμενοι λόγω της μετάθεσης, ευθύνονται για την δημιουργία του καρκίνου. Η πρώτη επιβεβαίωση της υπόθεσης αυτής στάθηκε η ανακάλυψη ότι στην μετάθεση (8;14) που χαρακτηρίζει τα λεμφώματα Burkitt, συμμετέχει το γνωστό ήδη ογκογονίδιο c-myc, του οποίου η λειτουργία σχετίζεται άμεσα με τον πολ/σμό και την διαφοροποίηση του κυττάρου. Βρέθηκε επιπλέον ότι στα πλαίσια της μετάθεσης αυτής, το c-myc μεταφέρεται μέσα στον γόνο της βαρείας αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (IgH), ενός γόνου τελείως ειδικού και άμεσα σχετιζόμενου με την λειτουργία των Β-λεμφοκυττάρων από τα οποία εξ άλλου εξορμάται το λέμφωμα Burkitt. Την συγκλονιστική αυτή ανακάλυψη σύντομα ακολούθησε η μελέτη και περιγραφή της μετάθεσης t(14;18) που χαρακτηρίζει τα οζώδη λεμφώματα που επίσης εξορμούν από Β-λεμφοκύτταρα. Βρέθηκε ότι στα σημεία θραύσης των χρωμοσωμάτων που συμμετέχουν στην μετάθεση βρίσκονται αφ' ενός ο γόνος της IgH και αφετέρου ένας νέος γόνος που ονομάστηκε bel-2 (Β cell leukemia lymphoma). Ο γόνος αυτός χαρακτηρίστηκε σαν ογκογονίδιο, στο μέτρο που όπως φάνηκε, σταθερά εμπλέκεται στην γενετική βλάβη που χαρακτηρίζει τον τύπο αυτό του λεμφώματος. Στην μετάθεση t(11;14) συμμετέχει, στο πρότυπο των 2 παραπάνω, ο γόνος της IgH και το ογκογονίδιο bcl-1. Όλα αυτά τα στοιχεία εδραίωσαν την υπόθεση που είχε διατυπωθεί ότι οι χρωμοσωμιακές μεταθέσεις αποτελούν την γενετική βάση των χρωμοσωμάτων που χαρακτηρίζουν. Η ερώτηση που τέθηκε στην συνέχεια ήταν, πώς ακριβώς συμβαίνει αυτό. Με ποιο δηλαδή μηχανισμό καταλήγει η μετάθεση στην απορρύθμιση του ογκογονιδίου που συμμετέχει σ' αυτήν και με ποιο μηχανισμό οδηγεί η απορρύθμιση αυτή στην γένεση του καρκίνου. Η μετάθεση (8;14) που φέρει το ογκογονίδιο c-myc μέσα στον γόνο της βαρείας αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης, ήταν η πρώτη που περιγράφηκε και μελετήθηκε σε βάθος. Η έρευνα απέδειξε ότι λόγω ακριβώς της μετάθεσης, το c-myc μεταφέρεται σε θέση που γειτονεύει με τον ισχυρότατο ενισχυτή του γόνου της IgH, με αποτέλεσμα να βρίσκεται σε συνεχή λειτουργία μεταγραφής. Ας σημειωθεί ότι φυσιολογικά το c-myc μεταγράφεται μόνον κατά την φάση εκείνη του κυτταρικού κύκλου κατά την οποία το κύτταρο, έχοντας δεχθεί ένα συγκεκριμένο ερέθισμα, ετοιμάζεται να διαιρεθεί. Η λειτουργία, του c-myc διακόπτεται ταχύτατα μετά την επίδραση του μιτωσιογόνου ερεθίσματος. Είναι εύκολο με βάση αυτά τα δεδομένα να συνδυάσει κανείς την συνεχή λειτουργία του c-myc με την δημιουργία ενός νεοπλασματικού κυτταρικού πληθυσμού ο οποίος εξ ορισμού χαρακτηρίζεται από συνεχή και ακατάπαυστο πολλαπλασιασμό των κυττάρων που τον συνθέτουν. Η μοριακή μελέτη της μετάθεσης t(14;18) που χαρακτηρίζει πάνω από το 80% των οζωδών λεμφωμάτων, βασίστηκε στο πρότυπο μελέτης της t(8;14). Και στην περίπτωση αυτή βρέθηκε ότι το ογκογονίδιο bel-2 που συμμετέχει στην μετάθεση, όπως ακριβώς και το c-myc, μεταγράφεται μόνον όταν τα Β-λεμφοκύτταρο δεχθεί ένα αντιγονικό ερέθισμα και ταχύτατα η λειτουργία του διακόπτεται αφού έχει οδηγήσει το κύτταρο σε κύκλο διαίρεσης. Η απορρύθμιση του bcl-2, αντίθετα απ' ότι συμβαίνει με το c-myc είναι δύσκολο να ερμηνευθεί, διότι τα σημεία θραύσης που έχουν περιγραφεί στο ογκογονίδιο αυτό, (MBR-major breakpoint region και MCR-minor cluster region), βρίσκονται σε μη λειτουργικές περιοχές του γόνου. Η μελέτη αυτή είχε στόχο την λεπτομερή χαρτογράφηση του bcl-2 σε μια μεγάλη σειρά οζωδών λεμφωμάτων, προκειμένου να διερευνηθεί η συχνότητα με την οποία συμμετέχουν στην μετάθεση (14;18) τα γνωστά έως τώρα σημεία θραύσης του bcl-2. Σύγχρονα με το bcl-2 μελετήθηκε και ο γόνος της IgH. Εξετάσθηκαν 52 οζώδη λεμφώματα, που συνιστούν την μεγαλύτερη σειρά της βιβλιογραφίας. Σε 43 από τις περιπτώσεις αυτές υπήρχε και καρυοτυπική ανάλυση. Η μελέτη έγινε σε DNA που απομονώθηκε από ιστό βιοψίας με την χρήση 5 DNA ανιχνευτών (3 για το bcl-2 και 2 για την IgH) και βασίσθηκε σε επανειλημμένους υβριδισμούς του υπό μελέτη υλικού που είχε κατ' αρχήν επωασθεί με 4 περιοριστικά ένζυμα. To bcl-2 βρέθηκε αναδιαταγμένο σε 37 (71%) από τις περιπτώσεις που μελετήθηκαν. Στις περιπτώσεις αυτές συμπεριλαμβάνονται και 5/6 που εμφάνιζαν φυσιολογικό καρυότυπο, αποδεικνύοντας έτσι την μεγαλύτερη ευαισθησία της μοριακής μεθόδου ανίχνευσης της μετάθεσης. Η συχνότητα εμφάνισης των σημείων θραύσης ήταν: MBR 81% και MCR 16%, ενώ μόνο σε μια περίπτωση το bcl-2 εμφάνιζε αναδιάταξη στην 5' περιοχή του. Το πιο ενδιαφέρον εύρημα της μελέτης αυτής ήταν η για πρώτη φορά ανίχνευση μιας επιπλέον βλάβης στην 5' περιοχή του γόνου σε 7 περιπτώσεις οι οποίες έφεραν κατ' αρχήν την μείζονα βλάβη στο MBR (6) και στο MCR (1) σημείο. Η επιπλέον αυτή βλάβη του bcl-2 εκτιμήθηκε περιορισμένης έκτασης, πιθανότατα ένα μικρό έλλειμμα ή μια σημειακή μετάλλαξη, θεωρείται δε , λόγω της θέσης της - στην 5' περιοχή όπου βρίσκονται συγκεντρωμένες οι αλληλουχίες που ελέγχουν την λειτουργία του γόνου - πολύ σημαντική. Διατυπώνεται η υπόθεση ότι ενδεχόμενα, η μικρή αυτή βλάβη στην καίρια αυτή περιοχή του γόνου ευθύνεται για την απορρύθμιση του.