Investigation of health promoting edible plants and gastrointenstinal availability and metabolism of olive oil polyphenols through an in vitro GID-Colon model

Abstract

Based on world health organization (WHO) most recent data, chronic diseases constitute the leading cause of deaths in modern societies1. Chronic disease rates are accelerating globally, advancing across every region, and pervading all socioeconomic classes. Cardiovascular diseases (CVD), cancer, obesity, and chronic obstructive pulmonary disease are the most frequently disorders in western populations and linked by common and preventable biological risk factors. It has been found that ageing and disease processes induce inflammation that decreases physical function and increases the risk for ageing-associated diseases2. In this regard, high blood pressure, high blood cholesterol and overweight are the main factors which are related to major behavioral risk factors and specifically unhealthy diet, physical inactivity, and tobacco use.After many years of research, scientists have postulated that food and human nutrition are regarded as the main axis for human well-being and are strictly associated with improved life quality and increased life expectancy. It first came to scientific attention with the seven countries study, in which results supported that Mediterranean countries of southern Europe have lower mortality rate from CVDs than in North America and northern Europe3. Analyzing thoroughly these observations and starting from the famous quote “Let food be the medicine, and let medicine be the food” until to recent advances and clinical observations, is evident that diet frames the balance of human system and the key-feature for healthy-ageing is prevention. It has been proved that human dietary habits could serve as nutritional shield against age-related diseases and promote healthy ageing. The findings that diet interventions can increase lifespan, set dietary plants a promising source of chemical entities that promote healthy span and/or delay ageing 4. Towards this purpose several foods or food-based products have been studied for exploration of their biological impact as well as their content in phytonutrients. The recent advances in medicine and the increased research around natural products (NPs) have awaken the health-consciousness of people and the adaption of well-being lifestyle approaches. To-date Mediterranean diet (MD) is in the limelight of epidemiologists and nutritionists interest and year-by-year new data arise regarding the positive impact of MD lifestyle and several associations between specific foods and diseases prevention5. The philosophy and the basics of such diets has been adopted and adjusted in synchronous patterns to cover the modern way of life and needs. Nutraceuticals is one of the recent elements introduced in our daily routine, while are defined as edible plants, dietary supplements and medicinal food, with a distinctive health impact in either prevention and/or treatment of disease4. In general, there is a plethora of definitions regarding nutraceuticals; yet the concept in all terminologies remain same and underlines their contribution to health maintenance and diseases prevention. Herbal/medicinal plants, also known as functional foods, usually serve as source for nutraceuticals production. These plants are rich in phytochemicals which apart from forming the shield of plants against several exogenous factors act also as protectors from human diseases. Flavonoids, tannins, phenolic acids, alkaloids, terpenoids, essential oils, saponins are few of NPs chemical classes with proven advantageous effects to human health 6.In the search for new biologically active substances, targeted bioassays play important role; in vitro and in vivo assays are mainly developed for extracts and/or pure compounds biological evaluation. However, despite the technological breakthrough that NPs drug discovery experiences and in spite of enormous efforts and investments, many active molecules in vitro fail when tested in vivo. This is mainly caused due to limited bioavailability and metabolisation processes (mostly under conditions of administration via the enteral route), which engender bio-transformations to molecules before reaching their final target. Intestinal absorption, hepatic metabolism, distribution in body tissues, bioconversion by the colonic microbiota with formation of colonic metabolites, and elimination are the main efficacy influencing factors. This is a very important drawback which, despite the impressive progress of the last years, does not allow the rationalization and the effectiveness of NPs discovery process. In addition, it is frequently observed that traditional medicinal plant extracts with a high level of ethnopharmacological and even clinical evidence, fail to show cell-based activity. The misleading “inactivity” of many NPs isolated from plants is likely caused because those are often pro-drugs, e.g., glycosides, which must undergo in vivo metabolic conversion (activation). Some well-known examples include the metabolic activation by gut bacteria of the isoflavone daidzein to the active metabolite equol, or of the phenolic compound salicin from willow bark to salicylic acid 7. Towards this purpose, new metabolisation assays have been developed, which mimic the metabolisation of compounds in the human body. One such example is the gastro-intestinal dialysis model (GIDM-colon) including microbial fermentation in the colon8. It is important to highlight that although these methods are used in pharmacological research, nonetheless they have not been used so far in NPs research.Therefore, the overall aim of the current thesis is to introduce an approach starting from the characterization of edible plants and/or foods, evaluation of their biological activity and finally metabolization study of certain bioactives. More specifically in the current thesis the phytochemical profile of several foodstuffs has been investigated incorporating new technologies and methods in NPs discovery and isolation in order to investigate the metabolism of natural entities coming from dietary plants, which promote healthy ageing. This is achieved by an integrated approach as illustrated in Figure 1. In parallel, NPs biotransformation reactions and metabolism in human system and explore the possible active forms of metabolites focusing on olive oil bioactives. Towards this direction an in vitro metabolism model was employed to study the behaviour and the bioavailability.The thesis is divided into two chapters. The first chapter focuses on biological screening via in vitro and in vivo assays of dietary plants with interesting phytochemical profile and promising biological results. Biological tests were centered between two key biological aspects, namely accumulating ROS elicited damages and the development of age-related metabolic diseases. A new approach is introduced by the parallel in vivo and in vitro testing and dereplication study of extracts and constituents thereof, with sophisticated analytical techniques in a successive and integrated manner.Chapter 2 aims towards a detailed investigation into the absorption, metabolism and microflora-dependent transformation of olive polar constituents, the Gastro-Intestinal Dialysis Model with Colon (GIDM-Colon) was applied. Specifically, in this chapter the anatomy and physiology of human alimentary canal, are described. The human gut microbiota and their significance in human health is extensively discussed, while the modulation of gut microbiota through dietetic maneuvers including olive polyphenols is also commented on. Successively, the so far ADMET assays and metabolisation protocols are discussed and the increasing need of in vitro assays that simulates human metabolism is presented. Moreover, the in vitro GIDM-Colon Model that was incorporated in this study is broadly described and statistical evaluation of GIDM-Colon results of each tested compound and TPF are discussed.

Με βάση τα πιο πρόσφατα στοιχεία του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ), οι χρόνιες ασθένειες αποτελούν την κύρια αιτία θανάτων στις σύγχρονες κοινωνίες. Τα ποσοστά χρόνιων ασθενειών επιταχύνονται παγκοσμίως, προχωρούν σε κάθε περιοχή και διαπερνούν όλες τις κοινωνικοοικονομικές τάξεις. Οι καρδιαγγειακές παθήσεις, ο καρκίνος, η παχυσαρκία και οι χρόνιες αποφρακτικές πνευμονοπάθειες είναι οι συχνότερα διαταραχές στους δυτικούς πληθυσμούς και συνδέονται με κοινούς και αποτρέψιμους παράγοντες βιολογικού κινδύνου. Έχει βρεθεί ότι η γήρανση και οι διεργασίες ασθένειας προκαλούν φλεγμονή που μειώνει τη φυσική λειτουργία και αυξάνει τον κίνδυνο για ασθένειες που σχετίζονται με τη γήρανση. Από αυτή την άποψη, η υψηλή αρτηριακή πίεση, η υψηλή χοληστερόλη στο αίμα και το υπερβολικό βάρος είναι οι κύριοι παράγοντες που σχετίζονται με σημαντικούς παράγοντες κινδύνου συμπεριφοράς και συγκεκριμένα ανθυγιεινή διατροφή, σωματική αδράνεια και χρήση καπνού. Μετά από πολλά χρόνια έρευνας, οι επιστήμονες υποστήριξαν ότι η τροφή και η ανθρώπινη διατροφή θεωρούνται ως ο κύριος άξονας της ανθρώπινης ευημερίας και συνδέονται αυστηρά με τη βελτιωμένη ποιότητα ζωής και το αυξημένο προσδόκιμο ζωής. Αρχικά ήρθε στην επιστημονική προσοχή με τη μελέτη των επτά χωρών, στην οποία τα αποτελέσματα υποστήριξαν ότι οι μεσογειακές χώρες της νότιας Ευρώπης έχουν χαμηλότερο ποσοστό θνησιμότητας από CVD από ό, τι στη Βόρεια Αμερική και τη βόρεια Ευρώπη. Αναλύοντας διεξοδικά αυτές τις παρατηρήσεις και ξεκινώντας από το περίφημο απόσπασμα «Αφήστε το φαγητό να είναι το φάρμακο και αφήστε το φάρμακο να είναι το φαγητό» μέχρι τις πρόσφατες εξελίξεις και τις κλινικές παρατηρήσεις, είναι προφανές ότι η διατροφή πλαισιώνει την ισορροπία του ανθρώπινου συστήματος και το βασικό χαρακτηριστικό για την υγιή- η γήρανση είναι πρόληψη. Έχει αποδειχθεί ότι οι ανθρώπινες διατροφικές συνήθειες θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως θρεπτική ασπίδα έναντι ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία και να προωθήσουν την υγιή γήρανση. Τα ευρήματα ότι οι διατροφικές παρεμβάσεις μπορούν να αυξήσουν τη διάρκεια ζωής, να ορίσουν τα φυτά διατροφής μια πολλά υποσχόμενη πηγή χημικών οντοτήτων που προάγουν την υγιή έκταση και / ή καθυστερούν τη γήρανση. Προς το σκοπό αυτό, έχουν μελετηθεί πολλά τρόφιμα ή προϊόντα με βάση τα τρόφιμα για την εξερεύνηση των βιολογικών τους επιπτώσεων καθώς και του περιεχομένου τους σε υψηλής βιολογικής αξίας συστατικά. Οι πρόσφατες εξελίξεις στην ιατρική και η αυξημένη έρευνα σχετικά με τα φυσικά προϊόντα έχουν ενισχύσει την συνείδηση των ανθρώπων αναφορικά με τον τρόπο ζωής τους. Σήμερα η μεσογειακή διατροφή βρίσκεται στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος των επιδημιολόγων και των διατροφολόγων και κάθε χρόνο προκύπτουν νέα δεδομένα σχετικά με τη θετική επίδραση του τρόπου ζωής της μεσογειακής διατροφής και αρκετών συσχετίσεων μεταξύ συγκεκριμένων τροφών και πρόληψης ασθενειών. Η φιλοσοφία και τα βασικά αυτών των διαίτων έχει υιοθετηθεί και προσαρμοστεί σε σύγχρονα πρότυπα για να καλύψει τον σύγχρονο τρόπο ζωής και ανάγκες. Τα Nutraceuticals είναι ένα από τα πρόσφατα στοιχεία που εισήχθησαν στην καθημερινή μας ρουτίνα, ενώ ορίζονται ως βρώσιμα φυτά, συμπληρώματα διατροφής και φαρμακευτικά τρόφιμα, με διακριτικό αντίκτυπο στην υγεία είτε στην πρόληψη και / ή τη θεραπεία νόσων. Σε γενικές γραμμές, υπάρχει μια πληθώρα ορισμών σχετικά με τα φαρμακευτικά προϊόντα. Ωστόσο, η έννοια σε όλες τις ορολογίες παραμένει ίδια και υπογραμμίζει τη συμβολή τους στη διατήρηση της υγείας και την πρόληψη ασθενειών. Φυτικά / φαρμακευτικά φυτά, επίσης γνωστά ως λειτουργικά τρόφιμα, χρησιμεύουν συνήθως ως πηγή παραγωγής φαρμακευτικών προϊόντων. Αυτά τα φυτά είναι πλούσια σε φυτοχημικά που εκτός από το σχηματισμό της ασπίδας των φυτών έναντι διαφόρων εξωγενών παραγόντων ενεργούν επίσης ως προστατευτικά από ανθρώπινες ασθένειες. Τα φλαβονοειδή, οι τανίνες, τα φαινολικά οξέα, τα αλκαλοειδή, τα τερπενοειδή, τα αιθέρια έλαια, οι σαπωνίνες είναι μερικές από τις χημικές κατηγορίες NPs με αποδεδειγμένα πλεονεκτικά αποτελέσματα στην ανθρώπινη υγεία. Στην αναζήτηση νέων βιολογικά δραστικών ουσιών, οι στοχευμένες βιοδοκιμές παίζουν σημαντικό ρόλο. Οι δοκιμασίες in vitro και in vivo αναπτύσσονται κυρίως για βιολογική αξιολόγηση εκχυλισμάτων και / ή καθαρών ενώσεων. Ωστόσο, παρά την τεχνολογική ανακάλυψη που βιώνει η ανακάλυψη φαρμάκων από NP και παρά τις τεράστιες προσπάθειες και επενδύσεις, πολλά ενεργά μόρια in vitro αποτυγχάνουν όταν δοκιμάζονται in vivo. Αυτό οφείλεται κυρίως σε περιορισμένες διαδικασίες βιοδιαθεσιμότητας και μεταβολισμού (κυρίως υπό συνθήκες χορήγησης μέσω της εντερικής οδού), οι οποίες προκαλούν βιο-μετασχηματισμούς σε μόρια πριν φτάσουν στον τελικό τους στόχο. Η εντερική απορρόφηση, ο ηπατικός μεταβολισμός, η κατανομή στους ιστούς του σώματος, η βιομετατροπή από τα μικροβιοτικά του παχέος εντέρου με σχηματισμό μεταβολιτών του παχέος εντέρου και η αποβολή είναι οι κύριοι παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα. Αυτό είναι ένα πολύ σημαντικό μειονέκτημα το οποίο, παρά την εντυπωσιακή πρόοδο των τελευταίων ετών, δεν επιτρέπει τον εξορθολογισμό και την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας ανακάλυψης NP. Επιπλέον, συχνά παρατηρείται ότι τα παραδοσιακά φαρμακευτικά εκχυλίσματα φυτών με υψηλό επίπεδο εθνοφαρμακολογικών και ακόμη και κλινικών ενδείξεων, δεν παρουσιάζουν δραστικότητα με βάση τα κύτταρα. Η παραπλανητική «αδράνεια» πολλών ΝΡ που έχουν απομονωθεί από φυτά πιθανότατα προκαλείται επειδή είναι συχνά προ-φάρμακα, π.χ. γλυκοσίδες, οι οποίες πρέπει να υποστούν in vivo μεταβολική μετατροπή (ενεργοποίηση). Μερικά γνωστά παραδείγματα περιλαμβάνουν τη μεταβολική ενεργοποίηση από τα βακτήρια του εντέρου της ισοφλαβόνης daidzein στο ενεργό μεταβολίτη ισοόλιο, ή της φαινολικής ένωσης σαλικίνη από φλοιό ιτιάς έως σαλικυλικό οξύ. Προς το σκοπό αυτό, έχουν αναπτυχθεί νέοι προσδιορισμοί μεταβολισμού, οι οποίοι μιμούνται το μεταβολισμό των ενώσεων στο ανθρώπινο σώμα. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι το μοντέλο προσομοίωσης του ανθρώπινου μεταβολισμού (GIDM-colon) που περιλαμβάνει μικροβιακή ζύμωση στο παχύ έντερο. Είναι σημαντικό να επισημανθεί ότι παρόλο που αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούνται στη φαρμακολογική έρευνα, ωστόσο δεν έχουν χρησιμοποιηθεί μέχρι στιγμής στην έρευνα φυσικών προϊόντων. Ως εκ τούτου, ο γενικός στόχος της παρούσας διατριβής είναι να εισαγάγει μια προσέγγιση ξεκινώντας από το χαρακτηρισμό των βρώσιμων φυτών ή / και των τροφίμων, την αξιολόγηση της βιολογικής τους δραστηριότητας και, τέλος, τη μελέτη μεταβολισμού ορισμένων βιοδραστικών. Πιο συγκεκριμένα στην παρούσα διατριβή, το φυτοχημικό προφίλ πολλών τροφίμων έχει διερευνηθεί ενσωματώνοντας νέες τεχνολογίες και μεθόδους στην ανακάλυψη και απομόνωση φυσικών προϊόντων, προκειμένου να διερευνηθεί ο μεταβολισμός των φυσικών οντοτήτων που προέρχονται από φυτά διατροφής, τα οποία προάγουν την υγιή γήρανση. Παράλληλα, οι αντιδράσεις βιομετασχηματισμού και ο μεταβολισμός των φυσικών προϊόντων στο ανθρώπινο σύστημα και διερευνούν τις πιθανές δραστικές μορφές μεταβολιτών που εστιάζουν στα βιοδραστικά του ελαιολάδου. Προς αυτή την κατεύθυνση χρησιμοποιήθηκε ένα in vitro μοντέλο μεταβολισμού για τη μελέτη της συμπεριφοράς και της βιοδιαθεσιμότητας τους.