Διερεύνηση του μηχανισμού δράσης της εκκρινόμενης ασυνουκλεΐνης: επιπτώσεις στην παθογένεια και στην εξέλιξη της νόσου Πάρκινσον

Abstract

In this thesis we studied the secretion mechanisms of alpha-synuclein and its effect on cell homeostasis. The study was performed by using proliferating SH-SY5Y neuroblastoma cell lines inducible expressing wild type (WT) α-synuclein. Τhe effect of chemical compounds, that inhibit specific non-classical pathways of secretion, showed that a-synuclein secretion is dependent on changes of intracellular calcium concentration. Since alpha-synuclein has been shown to be partly released by exosomes, we also attempted to examine the mechanism involved in exosome internalization by cells and thus the effect of a-synuclein as an exosomal cargo. In order to study the uptake mechanism, we initially examined the cells’ ability to internalize exosomes. The cells used were proliferating and differentiated neuroblastoma SH-SY5Y cells and primary neurons. Staining of the isolated exosomes with the specific dye Bodipy-Tr-Ceramide, and their subsequent application on the different cell cultures, showed that exosomes are readily internalized by the cells. Exosome uptake by cells was through a combination of different endocytosis mechanisms, but this result needs further elucidation. In addition, we attempted to study the effect of a-synuclein as exosomal cargo on neuronal homeostasis. The cell morphological parameter that was examined was cell volume, which was measured after the application of the different types of a-synuclein containing exosomes. Our results showed that mutant (A53T) protein may cause the reduction of cell volume. Finally, by using SH-SY5Y inducible expressing mutant asynuclein (ΔDQWT) that cannot be degraded by the lysosome, we examined the effect of chaperone mediated autophagy (CMA) deficiency on a-synuclein secretion either as free or associated with exosomes. Our study showed that a-synuclein secretion is reduced significantly in cells expressing the mutant form of the protein when compared with control cells expressing the wild type form. Intracellular protein levels did not vary. In addition, we observed increased loading of a-synuclein in exosomes. Furthermore, we also observed an increase in the phosphorylated form of a-synuclein (p-S129), which was mainly localized in the nucleus, and perturbation of proteasomal function and the formation of perinuclear polyubiquitin chains in the cells. It is noteworthy that these chains have similar structure with those observed after the application of proteasome inhibitors in cells that overexpress the wild type form of a-synuclein.Το sum up, in our study we investigated the role of a-synuclein in the spreading of Parkinson’s disease pathogenesis, by examining the protein’s secretion mechanisms, the mechanism of exosomes internalization by the cells, the effect of asynuclein forms on neuronal homeostasis and the role of autophagy in the secretion of the protein.

Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε τους μηχανισμούς έκκρισης της πρωτεΐνης α-συνουκλεΐνης και την επίδρασή της στην ομοιόσταση των κυττάρων. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν διαιρούμενα κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y τα οποία ύστερα από επαγωγή εκφράζουν αυξημένα επίπεδα της αγρίου τύπου α-συνουκλεΐνης (WT). Η επίδραση με χημικούς αναστολείς, οι οποίοι αναστέλλουν συγκεκριμένα μη κλασσικά μονοπάτια έκκρισης, έδειξε ότι η έκκριση της α-συνουκλεΐνης εξαρτάται από τις μεταβολές της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του ασβεστίου. Επειδή η α-συνουκλεΐνη έχει δειχθεί ότι εκκρίνεται μερικώς μέσω εξωσωμάτων, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην πρόσληψη των εξωσωμάτων από τα κύτταρα και συνεπώς την επίδραση της α-συνουκλεΐνης ως φορτίου αυτών. Για να μελετήσουμε το μηχανισμό πρόσληψης, αρχικά εξετάσαμε την ικανότητα των κυττάρων να προσλαμβάνουν τα εξωσώματα. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν διαιρούμενα και διαφοροποιημένα κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y και πρωτογενείς νευρώνες. Η χρώση των απομονωμένων εξωσωμάτων με την ειδική χρωστική Bodipy-Tr- Ceramide και στη συνέχεια η εφαρμογή τους στις διαφορετικές κυτταρικές σειρές, έδειξε ότι πράγματι τα εξωσώματα εισέρχονται στα κύτταρα. Η πρόσληψη των εξωσωμάτων από τα κύτταρα πραγματοποιήθηκε με συνδυασμό διαφορετικών μηχανισμών ενδοκύτωσης, αλλά το συγκεκριμένο αποτέλεσμα χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Παράλληλα, προσπαθήσαμε να μελετήσουμε την επίδραση της α-συνουκλεΐνης ως φορτίο των εξωσωμάτων στην ομοιόσταση των νευρώνων. Ο μορφολογικός παράγοντας του κυττάρου που εξετάστηκε ήταν ο κυτταρικός όγκος, ο οποίος μετρήθηκε ύστερα από την εφαρμογή εξωσωμάτων που περιείχαν διαφορετικού τύπου α-συνουκλεΐνη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η μεταλλαγμένου (A53T) τύπου μορφή της πρωτεΐνης προκαλεί μια τάση για μείωση του κυτταρικού όγκου. Τέλος, με τη χρήση κυττάρων νευροβλαστώματος SH-SY5Y τα οποία ύστερα από επαγωγή εκφράζουν συγκεκριμένη μετάλλαξη της α-συνουκλεΐνης (ΔDQWT), η οποία δεν αποικοδομείται από το λυσόσωμα, εξετάσαμε την επίδραση της έλλειψης αυτοφαγίας διαμεσολαβούμενης από σαπερόνες (CMA) στην έκκριση της α-συνουκλεΐνης ως ελεύθερης ή μέσω εξωσωμάτων. Η μελέτη μας έδειξε ότι η έκκρισή της μειώνεται σημαντικά στα κύτταρα που εκφράζουν τη μεταλλαγμένου τύπου μορφή της συγκριτικά με δείγμα ελέγχου κυττάρων που εκφράζουν την αγρίου τύπου μορφή της. Τα ενδοκυττάρια επίπεδα της πρωτεΐνης δε διαφέρουν. Επιπλέον παρατηρήσαμε αύξηση του φορτίου των εξωσωμάτων σε α-συνουκλεΐνη. Παράλληλα, παρατηρήσαμε και αύξηση στη φωσφορυλιωμένη μορφή της α-συνουκλεΐνης (p- S129) η οποία εντοπίστηκε κυρίως στον πυρήνα, μείωση της λειτουργίας του πρωτεασώματος και σχηματισμό πολυουβικιτινιλιωμένων αλυσίδων περιμετρικά του πυρήνα. Μάλιστα οι συγκεκριμένες αλυσίδες έχουν παρόμοια μορφολογία με εκείνες που δημιουργούνται ύστερα από επίδραση με αναστολείς του πρωτεασώματος σε κύτταρα που εκφράζουν αυξημένα επίπεδα της αγρίου τύπου μορφής της πρωτεΐνης. Συνοψίζοντας, στην εργασία μας διερευνήσαμε το ρόλο της α-συνουκλεΐνης στην εξάπλωση της παθογένειας της νόσου Πάρκινσον, μέσω της μελέτης των μηχανισμών έκκρισης της πρωτεΐνης, του μηχανισμού πρόσληψης των εξωσωμάτων από τα κύτταρα, της δράσης διαφορετικών μορφών της α-συνουκλεΐνης στη νευρωνική ομοιόσταση και του ρόλου της αυτοφαγίας στην έκκριση της πρωτεΐνης.