Διεργασίες υδρόλυσης λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας με τη χρήση καινοτόμων μικροβιακών βιοκαταλυτών για την παραγωγή βιοκαυσίμων

Abstract

The present Ph.D. thesis has to do with the enzymatic hydrolysis processes of pretreated lignocellulosic biomass at high initial solids content for the production of biofuels and especially bioethanol. Moreover, the production, biochemical characterization and technological evaluation of four novel enzymes, a xylanase and a mannanase from the thermophilic ascomycete Myceliophthora thermophila, and two glucuronoyl esterases from basidiomycetes Artolenzites elegans and Trametes ljubarskyi, were also conducted.Corn stover was the main source of lignocellulosic biomass, while in some cases beechwood sawdust was also utilized. The biomass was milled and subsequently underwent a pretreatment step in order to become vulnerable to enzymatic hydrolysis. The employed pretreatment processes were acetic acid-catalyzed hydrothermal pretreatment, steam explosion with and without the addition of an acid catalyst (H2SO4), organosolv pretreatment using a mixture of ethanol/water, and acetone/water oxidation. The assessment and selection of different pretreatment conditions in each case were conducted with glucose release and ethanol concentration as response factors. Furthermore, the effects of enzyme loading and initial solids concentration on cellulose conversion were investigated.Consequently, the pretreated biomasses underwent a liquefaction/ saccharification step at high solids content prior to simultaneous saccharification and fermentation process employing a custom made free-fall mixer. Maximum ethanol concentration and yield were found to be 76 g/L and 78 %, respectively, which are among the highest values reported in the literature. Moreover, the fermentation residues were used to produce biomethane in an attempt to enhance the energy efficiency of the whole process in the frame of the biorefinery concept.A second, complementary to the first, part this thesis, is the discovery of novel enzymes of high industrial and biotechnological interest. Such enzymes comprise a crucial step towards the improvement of the enzymatic arsenal against defense mechanisms of plant cell wall. The genes coding the desired enzymes were selected after an in silico analysis of lignocellulolytic microorganisms’ genomes. The genes were cloned and functionally expressed using the heterologous expression system of the methylotrophic yeast Pichia pastoris X33 and the biochemical characteristics, substrate specificity, and kinetic constants were determined for each recombinant protein.In the case of glucuronoyl esterases (AeGE15 και TlGE15), the biochemical characterization was carried out using a synthetic phenyl ester of D-glucuronic acid in an attempt to elucidate their role in plant cell wall degradation. The enzymatically prepared cinnamyl-D-glucuronate mimics bonds naturally occurring in the complex matrix of plant cell wall. Furthermore, the synergistic action of a recombinant GH26 mannanase (MtMan26A) with a commercial cellulolytic enzymatic cocktail was examined. The addition of MtMan26A led to an improvement in glucose release from lignocellulosic biomass by 12 %. Finally, the endoxylanase from M. thermophila (MtXyn30A) was found to be an appendage-dependent glucuronoxylan hydrolase, recognizing 4-O-methyl-D-glucuronic as substrate specificity determinant. This interesting property allows the enzyme to be used for the production of branched acidic xylooligosaccharides, which are known not only for their prebiotic action but also for their beneficial effects on human health.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εξετάστηκαν διεργασίες ενζυμικής υδρόλυσης προκατεργασμένης λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις στερεών με σκοπό την παραγωγή βιοκαυσίμων, με ιδιαίτερη έμφαση στη βιοαιθανόλη. Επιπλέον, μελετήθηκε η παραγωγή, ο βιοχημικός χαρακτηρισμός και η τεχνολογική αξιοποίηση τεσσάρων καινοτόμων ενζύμων, μιας ξυλανάσης και μιας μαννανάσης από το θερμόφιλο ασκομύκητα Myceliophthora thermophila και δύο εστερασών του γλυκουρονικού οξέος της ημικυτταρίνης από τους βασιδιομύκητες Artolenzites elegans και Trametes ljubarskyi. Η κύρια πηγή λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας που χρησιμοποιήθηκε ήταν τα στελέχη αραβόσιτου ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν και ρινίσματα ξύλου οξιάς. Αφού η βιομάζα οδηγήθηκε στην επιθυμητή κοκκομετρία μέσω άλεσης, οι μέθοδοι προκατεργασίας που αξιολογήθηκαν, προκειμένου αυτή να καταστεί ευάλωτη στο μετέπειτα στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης, ήταν η υδροθερμική προκατεργασία ενισχυμένη με αραιό οξικό οξύ, η έκρηξη ατμού με και χωρίς την προσθήκη θειικού οξέος, η προκατεργασία organosolv με χρήση μίγματος νερού/ αιθανόλης και η υγρή οξείδωση με χρήση μίγματος ακετόνης/ νερού. Η αξιολόγηση και η επιλογή των συνθηκών προκατεργασίας πραγματοποιήθηκε με παράγοντες απόκρισης την απελευθέρωση γλυκόζης κατά την ενζυμική υδρόλυση και την παραγωγή αιθανόλης σε κάθε περίπτωση. Επίσης, μελετήθηκαν η επίδραση του ενζυμικού φορτίου και η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης στερεών στη μετατροπή της κυτταρίνης σε γλυκόζη.Στη συνέχεια η προκατεργασμένη, στις επιλεχθείσες συνθήκες, βιομάζα οδηγήθηκε σε διεργασία παραγωγής αιθανόλης ταυτόχρονης σακχαροποίησης και ζύμωσης με ενσωματωμένο ένα προγενέστερο στάδιο ρευστοποίησης/ σακχαροποίησης σε υψηλή συγκέντρωση στερεών με τη βοήθεια αυτοσχέδιου αναμεικτήρα ελεύθερης πτώσης. Η εφαρμογή της παραπάνω διεργασίας σε συνδυασμό με την προκατεργασμένη, στις βέλτιστες συνθήκες, βιομάζα οδήγησε σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης έως και 76 g/L, καθώς και σε υψηλές αποδόσεις (78 %). Ακόμα, υπολείμματα της αλκοολικής ζύμωσης χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή βιομεθανίου σε μια προσπάθεια ενίσχυσης της ενεργειακής απόδοσης της διεργασίας στα πλαίσια ενός βιοδιυλιστηρίου. Η ανακάλυψη καινοτόμων ενζύμων με ιδιότητες που τα καθιστούν υψηλού βιομηχανικού και τεχνολογικού ενδιαφέροντος αποτελεί σημαντικό βήμα προς την ενίσχυση του ενζυμικού οπλοστασίου εναντίον των μηχανισμών άμυνας του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος. Η επιλογή των γονιδίων που κωδικοποιούν τα επιθυμητά ένζυμα πραγματοποιήθηκε μετά από in silico ανάλυση των γονιδιωμάτων των μικροοργανισμών. Τα γονίδια κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν λειτουργικά μέσω του συστήματος ετερόλογης έκφρασης της μεθυλότροφης ζύμης Pichia pastoris X33. Ακολούθησε προσδιορισμός των βιοχημικών χαρακτηριστικών των ανασυνδυασμένων ενζύμων, πλήρης χαρακτηρισμός της εξειδίκευσης υποστρώματος, καθώς και προσδιορισμός των κινητικών σταθερών. Στην περίπτωση των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος (AeGE15 και TlGE15), ο βιοχημικός χαρακτηρισμός και η κινητική μελέτη πραγματοποιήθηκαν με χρήση ενός συνθετικού, ανάλογου των φυσικών, υποστρώματος, του εστέρα της κινναμυλικής αλκοόλης με D-γλυκουρονικό οξύ. Η συγκεκριμένη κινητική μελέτη αποτέλεσε μια εκ των πρώτων μελετών όπου χρησιμοποιήθηκε φαινολικός εστέρας του D-γλυκουρονικού οξέος, συμβάλλοντας στην προσπάθεια διαλεύκανσης του ρόλου των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος στην αποικοδόμηση του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος.Επιπλέον, μελετήθηκε η συνεργιστική δράση μεταξύ της ανασυνδυασμένης μαννανάσης της οικογένειας GH26 (MtMan26A) και εμπορικού κυτταρινολυτικού σκευάσματος. Η προσθήκη της MtMan26A είχε ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της ενζυμικής υδρόλυσης λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας αυξάνοντας την απελευθέρωση γλυκόζης κατά 12 %. Εν τέλει, η ξυλανάση της οικογένειας GH30 (MtXyn30A) χρησιμοποιήθηκε για την επιτυχή υδρόλυση γλυκουρονοξυλάνης ξύλου οξιάς, καθώς και για την παραγωγή όξινων ξυλοολιγοσακχαριτών οι οποίοι είναι γνωστοί τόσο για την πρεβιοτική τους δράση όσο και για τις ευεργετικές τους ιδιότητες στον ανθρώπινο οργανισμό.