Η διερεύνηση νέων microRNA που παίζουν ρόλο στην δημιουργία καρκίνου ήπατος μέσα από υψηλής τεχνολογίας ανάλυση

Abstract

Identification of Novel MicroRNAs Involved in Hepatocellular Carcinogenesis by High Throughput screening. Abstract-background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second leading cause of cancer-related death in men and the sixth in women. Those numbers reflect the aggressiveness of this disease while at the same time mirror the absence of effective therapeutic regimens. There have been conducted hundreds of clinical trials in which either combination chemotherapies or small molecule inhibitors and recently immune checkpoint inhibitors have been studied. However the only FDA approved drug for unresectable or metastatic HCC is sorafenib which is a tyrosine kinase inhibitor. Our interest was to identify genes that play a role in liver oncogenesis and so we directed our focus to study a novel class of small non coding RNAs, the microRNAs.MicroRNAs have been involved in the pathogenesis of different types of cancers, including liver cancer. Specific microRNA signatures have been identified to be deregulated in HCC patient tissues and also to correlate with different clinicopathological parameters including survival. Having all this in mind our mission was to identify microRNAs that have both functional and clinical relevance in HCC and examine their downstream signaling effectors. Methods: In this study, we have screened the human microRNAome, aiming to identify microRNAs that are potent regulators of HCC invasiveness. Initially we received 24 tissues from patients with liver cancer along with 14 from adjacent non tumor specimens. RNA extraction was performed and microRNA and gene expression levels were measured by quantitative real-time RT-PCR. We determined the expression levels of miR-9, miR-21 and miR-224 in those samples. Simultaneously a novel microRNA library screen was done after plating SNU-449 liver cancer cells in 96-well plates. Those were transfected with a microRNA library consisting of 316 microRNA mimics and 2 negative controls. 48hrs post transfection we evaluated the SNU-449 cell invasiveness. We also performed invasion assays in SNU-449 cells 24hrs after transfection specifically with miR-9 and anti-miR-9 and their respective controls. A TargetScan algorithm was used to identify miR-9 downstream direct targets based on bioinformatics. Those analyses were validated by performing 3’UTR luciferase assay. Precisely, we transfected SNU-449 cells with the reporter vectors carrying the 3’UTR of CDH1 or PPARA. The constructs harbored the seed sequence of miR-9 (wildtype) or had a deletion of this sequence (miR-9 mutant). At 24 hours, they were transfected with miR-9 or miR-control and at 48 hours luciferase activity was measured. We have also performed transfection with microRNA mimic for mir-9 overexpression as well as microRNA inihibitor to suppress the miR-9 activity and observed the expression levels of the downstream targets CDH1, PPARA, PDK4 and vimentin. Furthermore we performed cell proliferation as well as assessed sphere formation and colony assay in SNU-449 and HepG2 liver cancer cell lines, both of which were transfected with miR-9 and anti-miR-9 along with their respective controls. Results: First we performed a high-throughput microRNA screen in SNU-449 liver cancer cells and assessed their invasiveness while secondly we evaluated in tissue the expression levels of the microRNAs derived from the above screen. Overexpression of miR-9 was found to be the top inducer of SNU-449 cell invasiveness, cell growth and their ability to form colonies in soft agar. Furthermore miR-9 levels were found in tissue to increase during HCC progression. Bioinformatics and 3’UTR luciferase analyses identified E-cadherin (CDH1) and peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARA) as direct downstream effectors of miR-9 activity. Inhibition of PPARA suppressed CDH1 mRNA levels, suggesting that miR-9 regulates CDH1 expression directly through binding in its 3’UTR and indirectly through PPARA. On the other hand, miR-9 inhibition of overexpression suppressed HCC tumorigenicity and invasiveness. PPARA and CDH1 mRNA levels were decreased in HCC relative to controls and were inversely correlated with miR-9 levels.Conclusions: Our study identified a novel microRNA signaling pathway, consisting of miR-9, PPARA and CDH1 that is deregulated in HCC patients affecting liver cancer cellular invasiveness and metastatic potential.

Η διερεύνηση νέων MicroRNA που παίζουν ρόλο στην δημιουργία καρκίνου ήπατος μέσα από υψηλής τεχνολογίας ανάλυση. Περίληψη-ιστορικό: Το ηπατοκυταρρικό καρκίνωμα ή ηπάτωμα είναι ο συχνότερος πρωτοπαθής κακοήθης όγκος του οργάνου αυτού (90-95%) και η συχνότερη αναλογικά θανατηφόρος κακοήθης νεοπλασία. Συγκεκριμένα ο καρκίνος του ήπατος είναι η δεύτερη αιτία θανάτου λόγω καρκίνου για τους άντρες και η έκτη αιτία για τις γυναίκες. Αυτές οι στατιστικές αναλύσεις αντικατοπτρίζουν την επιθετικότητα αυτού του όγκου καθώς και την εως τώρα έλλειψη αποτελεσματικών θεραπειών στο συγκεκριμένο πεδίο. Έχουν διεξαχθεί εκατοντάδες κλινικές δοκιμές είτε με συνδυασμό χημικοθεραπευτικών σχημάτων είτε με μικρομοριακούς αναστολείς και πρόσφατα αναστολείς του ανοσοποιητικού συστήματος. Παρ’όλα αυτά το μόνο φάρμακο εγκεκριμένο από τον ΕΟΦ για ανεγχείρητους ή μεταστατικούς όγκους είναι το sorafenib που είναι αναστολέας της τυροσινικής κινάσης.Ο σκοπός μας ήταν να βρούμε γονίδια που παίζουν ρόλο στην δημιουργία του ηπατοκυτταρικού καρκίνου και έτσι κατευθύναμε τον στόχο μας στο να μελετήσουμε και να καταλάβουμε κάποια νέα μικρά γονίδια που δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνες και λέγονται microRNAs.Τα microRNAs έχουν εμπλακεί στην παθογένεια διαφορετικών καρκίνων συμπεριλαμβανομένου αυτού του ήπατος. Συγκεκριμένες microRNA υπογραφές έχουν βρεθεί να είναι απορρυθμισμένες στους ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και να συσχετίζονται με την επιβίωση.ΜΕΘΟΔΟΙΣε αυτήν την μελέτη εξετάσαμε το ανθρώπινο microRNA γονιδίωμα. Επίπεδα έκφρασης των microRNA και γονιδίων μετρήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR σε ιστούς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και φυσιολογικούς ιστούς. Ο αλγόριθμος TargetScan χρησιμοποιήθηκε για να βρεθούν οι άμεσοι στόχοι καθοδικά του microRNA-9. Αποτελέσματα: Μέσα από υψηλής τεχνολογίας ανάλυση του ανθρώπινου microRNA γονιδιώματος βρήκαμε 28 microRNAs που είναι ρυθμιστές και προαγωγείς της επιθετικότητας των ηπατικών κυτταρικών σειρών. MiR-9, miR-21 και miR-224 ήταν οι 3 πρώτοι επαγωγείς της επιθετικότητας και η έκφραση τους ήταν πιο αυξημένη στους ιστούς με καρκίνο από ότι τους φυσιολογικούς. Ο συνδυασμός των κλινικών και μοριακών δεδομένων έδειξε ότι το mir-9 ήταν το πρώτο με κλινική και λειτουργική σπουδαιότητα. Τα επίπεδα του συσχετίζονταν με την σταδιοποίηση των ασθενών με ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η υπερέκφραση του miR-9 in vitro , επάγει στις SNU-449 και HepG2 κυτταρικές σειρές την κυτταρική ανάπτυξη, επιθετικότητα και ικανότητα τους να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Μέσα από βιοπληροφορική και ανάλυση λουσιφεράσης βρήκαμε ότι η e-cadherin και το peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARA) είναι οι άμεσοι στόχοι καθοδικά του microRNA-9. Αναστολή του PPARA καταστέλλει τα επίπεδα του mRNA της e-cadherin γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-9 ρυθμίζει την έκφραση της e-cadherin άμεσα μέσω σύνδεσης στο 3’UTR του γονιδίου και έμμεσα μέσω PPARA. Επιπρόσθετα η αναστολή της υπερέκφρασης του miR-9 μειώνει την ογκογονικότητα καθώς και την επιθετικότητα του όγκου. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του PPARA και της e-cadherin ήταν μειωμένα στους ιστούς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα σε σχέση με τους φυσιολογικούς και αντιστρόφως ανάλογα με τα επίπεδα του miR-9. Συμπέρασμα: Εν κατακλείδι, αυτή η μελέτη περιγράφει για πρώτη φορά τον σημαντικό ρόλο του μονοπατιού σηματοδότησης miR-9/PPARA/e-cadherin στην δημιουργία καρκίνου του ήπατος. Με βάση αυτήν την εργασία ο επιστημονικός στόχος μας είναι να χρησιμοποιήσουμε μη αναστρέψιμους αναστολείς του miR-9 σε κλινικές δοκιμές πρώτης φάσεως με ελπίδα να χρησιμοποιηθούν ως πιθανή θεραπεία του ηπατοκυταρρικού καρκίνου.