Η μοριακή σταδιοποίηση με Multiplex PCR στο μελάνωμα

Abstract

Malignant melanoma (MM) is a form of skin cancer originating from melanocytes (cells that produce the photoprotective pigment melanin). MM has a great metastatic potential via the lymphatic root or the bloodstream almost everywhere in the body, thus ranking as one of the most aggressive forms of cancer. Therefore, early diagnosis, accurate staging and appropriate therapy are essential for increasing life expectancy of melanoma patients. Prognosis of melanoma patients is based on histological data and the clinical image of the patients leading to misdiagnosis and downstaged subjects. Recently, the use of molecular markers has been tested for more precise staging of the disease. These markers may help diagnose early melanoma for better clinical management, better treatment follow-up, and more accurate detection of recurrence. Therefore, the detection of circulating melanoma cells (CMCs) in peripheral blood could screen-out patients with higher risk of relapse at the time of the diagnosis. The aims of this study are:• The design of a prognostic model for melanoma, using the detection of melanoma markers in blood specimens that may help reveal the minimal residual disease.• The correlation of CMCs detection with clinicopathological data, the prognosis (progression-free survival and overall survival) and the response to multiple protocols of treatment.• The creation of an easy and low cost technique that can be applied in any hospital lab to discriminate in a brief protocol, patients with subclinical residual disease.In this work, a group of melanoma specific markers has been studied that can be detected in mRNA samples from blood of melanoma patients. These markers were: tyrosinase (TYR), melanoma antigen recognized by T cells 1 (MELAN-A/MART-1), micropthalmia transcription factor isoform 4 (MITF-M) and GAPDH as internal control. A protocol has been set up to find the efficiency of our technique by spiking the melanoma cell line SK-MEL 28 cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy donors. Then a multiplex PCR protocol has been developed in which we could detect 1 SK-MEL 28 cell in 1.000.000 PBMCs for TYR and 1 SK-MEL 28 cell in 10.000.000 PBMCs for MART-1 and MITF-M. This protocol was tested in 81 melanoma patients of all stages in a blind study. Then the clinicopathological data of patients were collected correlated with our protocols’ results and statistic analysis was performed.The conclusions of this work are summarized as follows: the multiplex PCR protocol is correlated statistically with the stage of the disease as well as with the viability of patients. Specifically we can discriminate early staged patients from advanced staged patients with the number of markers that have been detected (p<0.001). Moreover the number of the markers detected correlates with survival or subclinical minimal residual disease that causes metastasis (p<0.01). We have set up a non interventional, low cost, easy and reliable protocol that could help the clinician to specify more accurately the stage of the disease and the prognosis of each patient.

Το κακόηθες μελάνωμα είναι μία μορφή καρκίνου του δέρματος που αναπτύσσεται από τα μελανοκύτταρα (κύτταρα του δέρματος που παράγουν τη φωτοπροστατευτική χρωστική μελανίνη) και διαθέτει υψηλή ικανότητα μετάστασης μέσω του λεμφικού συστήματος και μέσω του αίματος (αιματογενής διασπορά) σε οποιοδήποτε σημείο του σώματος με πολύ υψηλή, πλέον, την πιθανότητα θνησιμότητας. Η έγκαιρη διάγνωση, η ακριβής σταδιοποίηση και η κατάλληλη αντιμετώπιση αποτελούν τις προϋποθέσεις για καλή πρόγνωση της νόσου. Όσον αφορά τα κύρια κριτήρια πρόγνωσης και σταδιοποίησης του μελανώματος αυτά προέρχονται από ιστοπαθολογικά δεδομένα και την κλινική εικόνα του ασθενούς, δεδομένα περιορισμένης αξίας που συχνά οδηγούν σε λανθασμένη διάγνωση και υψηλό ποσοστό υποσταδιοποιημένων ασθενών. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνει προσπάθειες να καθορισθούν μοριακοί (καρκινικοί) δείκτες, η ανίχνευση των οποίων στο αίμα θα μπορούσε να συμβάλλει στην πρώιμη διάγνωση της νόσου, στην αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπευτικής αγωγής και στην παρακολούθηση των ασθενών μετά τη θεραπεία τους για την έγκαιρη διάγνωση τυχόν υποτροπής. Υπό αυτό το πρίσμα, η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων στο αίμα είναι ένας υποψήφιος μάρτυρας υποκλινικής-υπολειπόμενης νόσου, που δύναται να οδηγήσει σε μεταστάσεις και δεν ανιχνεύεται μέχρι σήμερα με τις συμβατικές μεθόδους. Η μελέτη αυτή έχει σαν σκοπό:• Το σχεδιασμό ενός προγνωστικού μοντέλου για το μελάνωμα, χρησιμοποιώντας την ανίχνευση έκφρασης ειδικών μοριακών καρκινικών δεικτών στο αίμα, αποβλέποντας στον καθορισμό της ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου.• Συσχέτιση της ύπαρξης των CΜCs με κλινικο-εργαστηριακά δεδομένα του πρωτοπαθούς όγκου, την εξέλιξη της νόσου (progression-free survival και overall survival) καθώς και σε μελλοντική μελέτη της αντικειμενικής απόκρισης της νόσου σε δεδομένα θεραπευτικά σχήματα.• Την δημιουργία μιας τεχνικής εφικτής στην καθημερινή κλινική χρήση η οποία και θα μπορεί σύντομα και με ακρίβεια να καθορίσει την ύπαρξη ασθενών με υποκλινική υπολειπομένη νόσο.Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε μια ομάδα εξειδικευμένων δεικτών για το μελάνωμα με σκοπό την ανίχνευση τους σε μεταγραφικό επίπεδο (RNA) σεπεριφερικό αίμα ασθενών με μελάνωμα. Επιλέχθηκαν η τυροσινάση (TYR: tyrosinase), το αντιγόνο μελανώματος αναγνωριζόμενο από τα Τ κύτταρα 1 (MELAN-A/MART-1: melanoma antigen recognized by T cells 1), την πρωτεΐνη με ενεργότητα αναστολής μελανώματος και το μεταγραφικό παράγοντα MITF (MITF-M, ισομορφή 4) και ως εσωτερικό μάρτυρα του πειράματος χρησιμοποιήθηκε ο δείκτης γκυκεραλδεϋδη-3-φωσφορική δεϋδρογονάση GAPDH. Επίσης, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο για εύρεση της ευαισθησίας της μεθόδου, με αραιώσεις κυττάρων μελανώματος SK-MEL 28 σε μονοπύρηνα φυσιολογικού δότη. Με την ανάπτυξη της multiplex PCR, όπου σε μία αντίδραση χρησιμοποιήσαμε όλους τους δείκτες (TYR, MART-1, MITF-M και GAPDH) προσδιορίσαμε ότι μπορούμε να ανιχνεύσουμε τα mRNA αντίγραφα για την τυροσινάση μέχρι 1 κύτταρο SK-MEL 28 σε υπόβαθρο 1.000.000 μονοπύρηνων κυττάρων αίματος, ενώ ανιχνεύουμε τα mRNA αντίγραφα για το MART-1 και το MITF-M μέχρι 1 κύτταρο SK-MEL 28 σε υπόβαθρο 10.000.000 μονοπύρηνων κυττάρων αίματος. Στη συνέχεια προχωρήσουμε σε ασθενείς οι οποίοι πάσχουν από μελάνωμα. Συλλέξαμε 81 δείγματα μελανώματος χωρίς να γνωρίζουμε εκ των προτέρων τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά κάθε ασθενούς. Απομονώσαμε το γενετικό υλικό (RNA) σε αυτά τα δείγματα και εφαρμόσαμε το πρωτόκολλο μας όπως ακριβώς αυτό είχε στηθεί κατά την εύρεση της ευαισθησίας της μεθόδου μας. Μετά το πέρας των αναλύσεων μας, συλλέξαμε τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Το επόμενο βήμα ήταν η συσχέτιση με τα αποτελέσματα της multiplex PCR, η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και η τελική αξιολόγηση της μεθόδου μας.Η ιδιαίτερη αξία της multiplex PCR έγκειται στην ανίχνευση των δεικτών μας ανάλογα του σταδίου και κυρίως ως προς την επίπτωση αυτής της ανίχνευσης στην επιβίωση. Στα αποτελέσματα μας αποδεικνύουμε ότι μπορούμε να ταυτίσουμε την ανίχνευση των δεικτών με τη νόσο ακόμα και με τα αρχικά στάδια, ενώ ταυτόχρονα μπορούμε να διακρίνουμε τις περιπτώσεις προχωρημένων σταδίων καθώς και ότι το στάδιο σχετίζεται με τον αριθμό των δεικτών που ανιχνεύονται (p<0,001). Επίσης, αποδείχθηκε ότι ο αριθμός των δεικτών που ανιχνεύονται σχετίζεται θετικά με την επιβίωση ή την πορεία για υποτροπή (p<0,01). Με αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουμε ότι έχουμε στήσει μια μη επεμβατική, φθηνή, αξιόπιστη, γρήγορη, εύκολη και απλή διαδικασία που μπορεί να μας βοηθήσει να προσδιορίσουμε ακριβέστερα το στάδιο και την πρόγνωση του ασθενούς (υποτροπή, πιθανότητα θανάτου).