Biochemical studies on blood coagulation mechanism: effect of recombinant von Willebrand factor-A1 domain on the process of hemostasis

Abstract

The hemostatic system is a vital protective mechanism for the control of excessive bleeding after injury in the vascular system, as well as for the prevention of a hypercoagulative state during the coagulation response. One of the most important systems within the human body is the vasculature, because all organs and tissues are dependent on it for survival. Blood is a vital part of the human physiology; a transport system that brings nutrients and oxygen to sustain living cells and simultaneously facilitates the removal of carbon dioxide and metabolic waste products from the tissues of the body. Therefore maintenance of the vascular system, termed hemostasis, is vital for survival and is the controlled arrest of bleeding and maintains vessel integrity with minimal blood loss. To assure the continuity of these functions, it is of uttermost importance to keep the flowing blood inside the vascular system at any cost. The complex process of blood coagulation is driven through a complex enzymatic pathway that involves several zymogen-to-enzyme conversion steps and allows the reaction to undergo great intrinsic amplification. The final step in this cascade is the conversion of soluble fibrinogen into an insoluble fibrin network. Thrombin plays a central role in the coagulation cascade and is the last compound that gets activated. During activation of coagulation, thrombin is the only enzyme that is freely available in blood circulation, where it encounters different substrates. It’s most relevant substrate is fibrinogen which is converted to fibrin by thrombin. Further more, in blood circulation, thrombin can induce physiological but often also pathological processes depending on the amount of available thrombin. Serine protease factor Xa (FXa), which functions principally at coagulation cascades catalyzes the conversion of prothrombin to thrombin at the sites of vascular injury. The serine protease domain of FXa is one of the most effective targets for developing direct anticoagulants for the coagulation disorders. The coagulation process is accelerated in the presence of calcium, and a phospholipid surface that is usually presented by the activated platelets, and will ultimately form a stabilizing fibrin network that will secure the platelet plug until the vessel wall is restored. von Willebrand factor (vWF) is a plasma protein that performs two main functions in hemostasis: it mediates platelet activation and adhesion to the injured vessel wall that leads to the formation of platelet thrombi and the subsequent arrest of bleeding. Furthermore, vWF protects coagulation factor VIII (FVIII) from rapid proteolytic inactivation. Cardiovascular diseases are one of the major causes of morbidity and mortality in the developed nations. Despite the continuous efforts by numerous laboratories all around the world, effective drug targets for diseases such as heart attack and stroke have not yet been identified. As of today this field stands in its early development stages only. There are numerous questions in this field of science which still require answers. As thrombin and FXa plays a fundamental role in the coagulation cascade, it is logical that the calculation of their levels, apart from a number of other important information, constitutes the most appropriate way to study the overall patients’ haemostatic status, therefore helping to monitor the patients’ condition. For example, this approach has recently been used for targeting potential extra-haemostatic effects as well as to identify patients at risk for recurrent venous thromboembolism. This piece of information makes extremely interesting the development of methods for monitoring thrombin and FXa production in vitro. Related to this vast area of science, in the present work we developed extremely simplified methods to determine thrombin and FXa production, which might be automatable. The most widely used chromogenic substrate was applied, several parameters involved in the reaction were examined and optimized in order to establish a rapid routine, less time consuming and suitable method for the evaluation of large numbers of clinical samples. The thrombin and FXa production values were compared in plasma samples before and after clot removal, correlation between FXa and thrombin production values have been calculated and also the effects of physical exercise, platelet count, FVIIa and tissue factor(TF) on thrombin and FXa production have also been carried out. Furthermore routine determination of this factor (Thrombin) in hospitalized diabetic patients under different anti-coagulating therapies have been carried out. As the coagulation cascade proceeds as a series of linked proteolytic reactions, the enzymes generated by these processes are not directly available for quantitative measurement because they are rapidly neutralized by naturally occurring protease inhibitors. To face these obstacles, we have also focused to the development of western blotting techniques in order to study blood clotting FX and its active form. In addition in the frame of this work we have investigated the potential function of purified vWF A1 domain protein in platelet activation and in the natural process of hemostasis in order to fully understand its particular role in maintaining the integrity of the blood coagulation. To this purpose the specific amino acid region (A1 domain) of vWF has been cloned, expressed in mammalian and bacterial cells, purified and used both as bacterial and cellular protein.

Το αιμοστατικό σύστημα είναι ένα ζωτικός μηχανισμός για τον έλεγχο υπερβολικής αιμορραγίας μετά από τραυματισμό στο αγγειακό σύστημα, καθώς και για την πρόληψη μιας κατάστασης υπερπηκτικότητας κατά τη διάρκεια της απόκρισης πήξης. Ένα από τα πιο σημαντικά συστήματα στο ανθρώπινο σώμα είναι το αγγειακό, επειδή όλα τα όργανα και οι ιστοί εξαρτώνται από αυτό για επιβίωση. Το αίμα είναι ένα ζωτικό μέρος της ανθρώπινης φυσιολογίας, ένα σύστημα μεταφοράς που φέρει θρεπτικά και οξυγόνο για να συντηρήσει τα ζωντανά κύτταρα και ταυτόχρονα να διευκολύνει την απομάκρυνση διοξειδίου του άνθρακα και μεταβολικών άχρηστων προϊόντων από τους ιστούς του σώματος. Για τον λόγο αυτό η συντήρηση του αγγειακού συστήματος, που καλείται αιμόσταση, είναι ζωτική για την επιβίωση και είναι η ελεγχόμενη διακοπή της αιμορραγίας, ενώ διατηρεί την ακεραιότητα του αγγείου με ελάχιστη απώλεια αίματος. Για να διασφαλιστεί η συνέχεια των λειτουργιών αυτών, είναι μέγιστης σημασίας η διατήρηση της ροής του αίματος μέσα στο αγγειακό σύστημα με κάθε κόστος. Η σύνθετη διεργασία της πήξης του αίματος οδηγείται μέσω ενός πολύπλοκου ενζυμικού μηχανισμού που αφορά μερικά μονοπάτια μετατροπής ζυμογόνου σε ένζυμο και επιτρέπει μεγάλη εσωτερική ενίσχυση της αντίδρασης. Το τελικό βήμα σε αυτές τις διαδοχικές αντιδράσεις είναι η μετατροπή του διαλυτού ινωδογόνου σε ένα αδιάλυτο ινικό δίκτυο. Η θρομβίνη παίζει ένα κεντρικό ρόλο και είναι η τελευταία ένωση που ενεργοποιείται. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της πήξης, η θρομβίνη είναι το μόνο ένζυμο που είναι ελεύθερα διαθέσιμο στην κυκλοφορία του αίματος, όπου συναντά διαφορετικά υποστρώματα. Το πιο κατάλληλο υπόστρωμα είναι το ινωδογόνο που μετατρέπεται σε ινώδες μέσω της θρομβίνης. Επιπλέον, στην κυκλοφορία του αίματος, η θρομβίνη μπορεί να επάγει φυσιολογικές αλλά συχνά και παθολογικές διεργασίες που εξαρτώνται από την ποσότητα της διαθέσιμης θρομβίνης. Η πρωτεάση σερίνης, παράγοντας Xa (FXa), που λειτουργεί κυρίως σε διαδοχικές αντιδράσεις πήξης καταλύει τη μετατροπή της προθρομβίνης σε θρομβίνη στις περιοχές του αγγειακού τραυματισμού. Η περιοχή της πρωτεάσης σερίνης του παράγοντα FXa είναι από τους πιο αποτελεσματικούς στόχους για την ανάπτυξη των άμεσων αντιπηκτικών για τις ανωμαλίες πήξης. Η διεργασία πήξης επιταχύνεται παρουσία ασβεστίου και μιας φωσφολιπιδικής επιφάνειας που συνήθως εμφανίζουν τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, και τελικά σχηματίζει ένα σταθεροποιημένο ινικό δίκτυο που θα διασφαλίσει την επικάλυψη του αιμοπεταλίου μέχρι το αγγειακό τοίχωμα να αποκατασταθεί. Ο παράγοντας van Willebrand (vWF) είναι μια πρωτεΐνη του πλάσματος που εκτελεί δύο βασικές λειτουργίες στην αιμόσταση: μεσολαβεί στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και στην επούλωση του τραυματισμένου αγγειακού τοιχώματος που οδηγεί στον σχηματισμό θρόμβων αιμοπεταλίων και την επακόλουθη διακοπή της αιμορραγίας. Επιπλέον, ο vWF προστατεύει τον παράγοντα πήξης VIII (FVIII) από τη γρήγορη πρωτεολυτική αδρανοποίηση. Οι καρδιαγγειακές ασθένειες είναι από τις σημαντικότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας στα ανεπτυγμένα κράτη. Παρά τις συνεχείς προσπάθειες από πολυάριθμα εργαστήρια ανά τον κόσμο, δεν έχουν προσδιοριστεί αποτελεσματικά θεραπευτικά εργαλεία για ασθένειες όπως το έμφραγμα του μυοκαρδίου και τα εγκεφαλικά επεισόδια. Έτσι σήμερα αυτό το ερευνητικό πεδίο βρίσκεται ακόμα στα πρώτα στάδια της εξέλιξής του. Υπάρχουν ακόμα πολυάριθμα ερωτήματα σε αυτό το επιστημονικό πεδίο τα οποία παραμένουν αναπάντητα. Εφόσον η θρομβίνη και ο FXa έχουν έναν θεμελιώδη ρόλο στον μηχανισμό της πήξης, είναι λογικό ότι ο υπολογισμός των επιπέδων τους, εκτός από πλήθος άλλων σημαντικών πληροφοριών, αποτελεί τον πιο ενδεδειγμένο τρόπο για την μελέτη της αιμοποιητικής λειτουργίας των ασθενών, επομένως βοηθά στην παρακολούθηση της κατάστασης των ασθενών. Παραδείγματος χάριν , αυτή η προσέγγιση προσφάτως έχει χρησιμοποιηθεί τόσο για τον προσδιορισμό πιθανών επιπρόσθετων αιμοστατικών επιδράσεων όσο και για την ταυτοποίηση ασθενών που βρίσκονται σε κίνδυνο επαναλαμβανόμενων φλεβικών θρομβικών εμβολών. Η πληροφορία αυτή καθιστά εξαιρετικά ενδιαφέρουσα την ανάπτυξη μεθόδων για την παρακολούθηση της παραγωγής της θρομβίνης και του FXa in vitro. Σχετικά με αυτόν τον ευρύ τομέα της επιστήμης, στην παρούσα εργασία αναπτύξαμε εξαιρετικά απλουστευμένες μεθόδους για τον προσδιορισμό της παραγωγής θρομβίνης και του FXa, οι οποίες μπορούν να αυτοματοποιηθούν. Εφαρμόστηκε το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο χρωμογόνο υπόστρωμα, εξετάστηκαν πολλαπλές παράμετροι που σχετίζονται με την αντίδραση και βελτιστοποιήθηκαν ώστε να καθιερωθεί μια μη χρονοβόρα ,κατάλληλη και ταχεία μέθοδος ρουτίνας για την αξιολόγηση μεγάλου αριθμού κλινικών δειγμάτων. Οι ρυθμοί παραγωγής θρομβίνης και του FXa συγκρίθηκαν σε δείγματα πλάσματος πριν και μετά την αφαίρεση θρόμβου. Στη συνέχεια, υπολογίστηκε ο συσχετισμός των τιμών της παραγωγής της θρομβίνης και του FXa. Επιπροσθέτως μελετήθηκαν οι επιδράσεις της φυσικής άσκησης, της συγκέντρωσης των αιμοπεταλίων, του FVIIa και του ιστικού παράγοντα (tissue factor TF) στην παραγωγή της θρομβίνης και του FXa. Επιπλέον προσδιορισμός ρουτίνας αυτού του παράγοντα (θρομβίνη) διεξήχθη σε νοσηλευόμενους διαβητικούς ασθενείς υπό διαφορετικές αντιπηκτικές θεραπείες. Καθώς αυτός ο μηχανισμός πήξης προχωρά σαν μια σειρά συνδεόμενων πρωτεολυτικών αντιδράσεων, τα ένζυμα που δημιουργούνται από αυτές τις διεργασίες δεν είναι διαθέσιμα άμεσα για ποσοτική μέτρηση επειδή αδρανοποιούνται ταχέως από ενδογενώς παραγόμενους αναστολείς πρωτεασών. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος εστιάσαμε στην ανάπτυξη τεχνικών ανοσοαποτύπωσης για να μελετηθεί ο παράγοντας της πήξης FX και η ενεργή του μορφή. Επιπρόσθετα στα πλαίσια αυτής της εργασίας μελετήσαμε την πιθανή λειτουργία της απομονωμένης επικράτειας Α1 του vWF στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και στη φυσιολογική διαδικασία της αιμόστασης, ώστε να κατανοηθεί πλήρως ο ιδιαίτερος ρόλος της στην διατήρηση της ακεραιότητας της διαδικασίας της πήξης του αίματος. Γι’ αυτόν τον σκοπό η συγκεκριμένη αμινοξική περιοχή (Α1 επικράτεια) του vWF, κλωνοποιήθηκε σε ευκαρυωτικά και βακτηριακά κύτταρα, απομονώθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως βακτηριακή αλλά και ευκαρυωτική πρωτεΐνη.