Ανοσοϊστοχημική και βιοχημική διερεύνηση της έκφρασης του γλυκοζυλιωμένου με Ο-Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη επιτόπιου Η στον εγκέφαλο

Abstract

The epitope H contains an O-Linked N-acetylglucosamine residue in a specific conformation and/or environment recognized by the mouse IgM monoclonal antibody H. The antibody H was raised against lamb oligodendrocytes. In the present study the distribution of the epitope H was investigated, by using the indirect immunoperoxidase method, in 190 formalin-fixed, paraffin embedded specimens including, 30 cases of normal human brains, 30 cases of normal lamb brains, 30 cases of normal rabbit brains, 30 cases of normal rat brains, 10 human brains of old persons with atrophy, 10 brains of infants with lesions of anoxic encephalopathy, 2 brains of premature neonates with anoxic encephalopathy, 9 specimens of human embryos in different weeks of gestation, 10 cases of gemistocytic astrocytomas, 10 cases of pilocytic astrocytomas, 10 cases of subependymal giant cell astrocytomas occurring in children with tuberous sclerosis, 5 cases of medulloblastomas and 1 case of PNET. In addition fresh frozen tissues of lamb brains and mixed cultures of lamb astrocytes and oligodendrocytes were stained using the double indirect immunofluorescence method and the primaxy IgM monoclonal mouse antibody H and the polyclonal rabbit anti-GFAP antibody. Finally, by using the Western-blot, immunoblot -method the localization of the epitope H was investigated, in the cultures of human astrocytoma U87 and D54 cell lines. In the immunoperoxidase stain the expression of the epitope H was graded as follows: Negative expression (-) when all cells were unstained, very low expression when less than 5% of the cells were stained, low expression when 5-30% of the cells were stained, moderate expression when 30-75% of the cells were stained and high expression when more than 75% of the cells were stained. The results of the present study are as follows: 1) All types of neurons of human, lamb, rabbit and rat brains remained negative for the epitope H. 2) The microglial cells of all brain specimens remained negative for the epitope H. 3) The oligodendrocytes of all brain specimens remained negative for the epitope H. 4) All the oligodendrocytes in the lamb tissue cultures revealed strong cell body and process staining for the epitope H. 5) The myelin of all brain specimens remained negative for the epitope H. 6) All the astrocytes in the lamb tissue cultures revealed strong cell body and process staining. 7) The astrocytes of the external glia limitans (surface of the brain) of all normal brain specimens showed high expression for the epitope H. 8) The protoplasmic astrocytes of the cerebral cortex and basal ganglia (cerebral hemispheric nuclei) of all normal brain specimens showed very low expression for the epitope H. 9) The fibrous astrocytes of the white matter of all normal brain specimens showed low expression for the epitope H. 10) The ependymal cells of the lamb, brains showed low expression for the epitope H. 11) The ependymal cells of the normal rabbit, rat and human brain specimens showed very low expression for the epitope H. 12) The ependymal cells of the normal human embryos remained negative for the epitope H. 13) The cells of the neural tube of the human embryos remained negative for the epitope H, except in two cases where they showed very low expression for the epitope H. In the 27 day-old human embryo the cell processes of the peripheral marginal zone showed strong stain and high expression for the epitope H. 14) The neural crest and its derivatives showed variable expression for the epitope H, in the human embryos. On the 26-day all cells were negative, on the 27-day the cells showed high expression, at seven weeks rare elongated cells were positive in the spinal ganglia, at eight weeks the spinal ganglia showed a positive paranuclear cytoplasmic spot in many cells. At 12 weeks the neurons and their satellite cells were negative for the epitope H, whereas the cells of the capsule and a good number of elongated cells within the ganglion were strongly stained for the epitope H. The schwann cells up to the 13th week up to which we had data remained negative for the epitope H. 15) The epithelial cells of the choroid plexus of the normal human brain specimens revealed high expression for the epitope H. 16) The epithelial cells of the choroid plexus of the lamb and rabbit brains revealed low expression for the epitope H. 17) The hypertrophic reactive astrocytes of the external glia limitans of the atrophic brains of old human persons revealed strong cytoplasmic stain and high expression for the epitope H. 18) The ependymal cells of the premature neonates and of the infants who died with signs of anoxic encephalopathy showed high expression for the epitope H. 19) The ten cases of gemistocytic astrocytomas showed high expression for the epitope H. 20) The ten cases of subependymal giant cell astrocytomas occurring in tuberous sclerosis showed high expression for the epitope H. 21) The ten cases of pilocytic astrocytomas showed a biphasic pattern of expression for the epitope H. The dense areas composed of elongated pilocytic astrocytes showed high expression and the loose areas composed of stellate (protoplasmic) astrocytes showed low expression. 22) The five cases of medulloblastomas and the one case of PNET remained negative for the epitope H. 23) The U87 and D54 human astrocytoma cell lines, with the method Western-blot – immunoblot revealed that the epitope H is present at four polypeptides on each cell line. The three polypeptides have similar molecular weights on both cell lines and these are 106KD, 56KD and 54 KD. There is a fourth polypeptide with 32KD in the U87 cell line and a fourth polypeptide with 33KD in the D54 cell line which bear the epitope H.

Το επιτόπιο Η αναγνωρίζεται από το μονοκλωνικό αντίσωμα Η. Το μονοκλωνικό αντίσωμα Η είναι της τάξεως IgM και δημιουργήθηκε σε ποντικό μετά από ένεση ολόκληρων σωμάτων ολιγοδενδρογλοιακών κυττάρων προβάτου. Το επιτόπιο Η περιλαμβάνει το σάκχαρο Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη αλλά και άλλα στοιχεία τα οποία μπορεί να είναι ή το παρακείμενο τμήμα της πολυπεπτιδικής αλύσου ή ο τρόπος που τοποθετείται το σάκχαρο στο μόριο της πολυπεπτιδικής αλύσου ή ο συνδυασμός και των δύο παραπάνω καταστάσεων. Έτσι το μονοκλωνικό αντίσωμα Η δεν αναγνωρίζει όλα τα πολυπεπτίδια που φέρουν το σάκχαρο Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, αλλά αναγνωρίζει έναν υποπληθυσμό αυτών των πολυπεπτιδίων που φέρουν το σάκχαρο με τις προϋποθέσεις που απαιτούνται για να δημιουργηθεί το επιτόπιο Η. Σε αυτή την μελέτη εξετάσθηκε η κατανομή του επιτοπίου Η με τη μέθοδο της έμμεσης ανοσοϋπεροξειδάσης σε 190 δείγματα τα οποία μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη και σκηνώθηκαν σε παραφίνη. Στα 190 δείγματα περιλαμβάνονται: 30 φυσιολογικοί εγκέφαλοι, ανθρώπων, 30 φυσιολογικοί εγκέφαλοι προβάτου, 30 φυσιολογικοί εγκέφαλοι κουνελιού, 30 φυσιολογικοί εγκέφαλοι επίμυων, 10 εγκέφαλοι υπερηλίκων ανθρώπων με ατροφία, 10 εγκέφαλοι βρεφών με ανοξική εγκεφαλοπάθεια, 2 εγκέφαλοι πρόωρων νεογνών με ανοξική εγκεφαλοπάθεια, 9 περιπτώσεις ανθρωπίνων εμβρύων σε διαφορετικά στάδια κυήσεως, 10 περιπτώσεις γεμιστοκυτταρικών, 10 περιπτώσεις τριχοκυτταρικών, 10 περιπτώσεις υποεπενδυματικών γιγαντοκυτταρικών αστροκυτωμάτων, 5 περιπτώσεις μυελοβλαστωμάτων και 1 περίπτωση PNET. Ακόμα με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού βάφηκαν μεικτές καλλιέργειες αστροκυττάρων και ολιγοδενδροκυττάρων προβάτου καθώς και τομές κρυοστάτου εγκεφάλων προβάτου. Με τη μέθοδο του Western-blot – immunoblot μελετήθηκε η κατανομή του επιτοπίου Η στα πολυπεπτίδια των κυτταρικών σειρών των ανθρωπίνων αστροκυτωμάτων U87 και D54. Τα αποτελέσματα της μελέτης είναι τα ακόλουθα: 1) Τα νευρικά κύτταρα όλων των εγκεφάλων του ανθρώπου, του προβάτου, του κουνελιού και του επίμυος παρέμειναν αρνητικά για το επιτόπιο Η. 2) Το ολιγοδενδρογλοιακά κύτταρα των εγκεφάλων όλων των ειδών παρέμειναν αρνητικά για το επιτόπιο Η. 3) Τα μικρογλοιακά κύτταρα των εγκεφάλων όλων των ειδών παρέμειναν αρνητικά για το επιτόπιο Η. 4) Η μυελίνη των εγκεφάλων όλων των ειδών παρέμεινε αρνητική για το επιτόπιο Η. 5) Τα ινώδη αστροκύτταρα της λευκής ουσίας των φυσιολογικών εγκεφάλων όλων των ειδών παρουσίασαν χαμηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 6) Τα αστροκύτταρα της εξωτερικής επιφάνειας των φυσιολογικών εγκεφάλων όλων των ειδών, τα οποία σχηματίζουν τον έξω αφοριστικό νευρογλοιακό υμένα παρουσίασαν υψηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 7) Τα πρωτοπλασματικά αστροκύτταρα του φλοιού και των βασικών γαγγλίων των εγκεφαλικών ημισφαιρίων όλων των ειδών των εγκεφάλων παρουσίασαν πολύ χαμηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 8) Τα επενδυματικά κύτταρα των εγκεφάλων του προβάτου παρουσίασαν χαμηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 9) Τα επενδυματικά κύτταρα των φυσιολογικών εγκεφάλων του ανθρώπου του κουνελιού και του επίμυος παρουσίασαν πολύ χαμηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 10) Τα επενδυματικά κύτταρα του Κ.Ν.Σ των ανθρωπίνων εμβρύων παρέμειναν αρνητικά για το επιτόπιο Η. 11) Τα επιθηλιακά κύτταρα του χοριοειδούς πλέγματος του φυσιολογικών εγκεφάλων του ανθρώπου παρουσίασαν υψηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 12) Τα κύτταρα του νευρικού σωλήνα των ανθρωπίνων εμβρύων παρουσίασαν αρνητική έκφραση για το επιτόπιο Η εκτός από μια περίπτωση που παρουσίασε χαμηλή έκφραση. 13) Τα επενδυματικά κύτταρα των εγκεφάλων των βρεφών που απεβίωσαν από ανοξική εγκεφαλοπάθεια παρουσίασαν υψηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 14) Τα αντιδραστικά υπερτροφικά αστροκύτταρα του έξω αφοριστικού νευρογλοιακού υμένα των ατροφικών εγκεφάλων των υπερηλίκων παρουσίασαν υψηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 15) Οι δέκα περιπτώσεις γεμιστοκυτταρικών και υποεπενδυματικών γιγαντοκυτταρικών αστροκυττωμάτων παρουσίασαν υψηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 16) Οι δέκα περιπτώσεις τριχοκυτταρικών (πιλοκυτταρικών) αστροκυττωμάτων παρουσίασαν διφασική έκφραση για το επιτόπιο Η με τις πυκνές περιοχές να παρουσιάζουν υψηλή και τις αραιές περιοχές χαμηλή έκφραση για το επιτόπιο Η. 17) Οι πέντε περιπτώσεις μυελοβλαστωμάτων και η μία περίπτωση PNET παρέμειναν αρνητικές για το επιτόπιο Η. 18) Οι σειρές των U87 και D54 των αστροκυτωμάτων με τη μέθοδο του Western-blot, immunoblot παρουσίασαν τέσσερα πολυπεπτίδια η κάθε μία που φέρουν το επιτόπιο Η. Τα τρία πρώτα με μοριακά βάρη 106KD, 56KD, 54KD είναι κοινά και στις δύο σειρές. Η σειρά U87 παρουσιάζει ένα τέταρτο πολυπεπτίδιο με μοριακό βάρος 32KD που φέρει το επιτόπιο Η και η σειρά D54 ένα τέταρτο πολυπεπτίδιο με μοριακό βάρος 33KD που φέρει το επιτόπιο Η. 19) Τα ολιγοδενδροκύτταρα του προβάτου στις κυτταροκαλλιέργειες παρουσίασαν έντονη χρώση του σωματικού κυτταροπλάσματος και των αποφυάδων τους για το επιτόπιο Η. 20) Τα αστροκύτταρα του προβάτου τόσο με τις πλατειές όσο και με τις στενές αποφυάδες στις κυτταροκαλλιέργειες παρουσίασαν έντονη χρώση του κυτταροπλάσματος για το επιτόπιο Η.