Μελέτη του ρόλου των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων στην παθογένεια των διαμέσων πνευμονοπαθειών

Abstract

INTRODUCTION: The term interstitial lung diseases encompasses a heterogeneous group of restrictive lung diseases with pulmonary fibrosis as the common point. Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a progressive, devastating fibrotic diffuse parenchymal disease which often culminates to a fatal outcome 3-5 years after diagnosis, regardless of treatment. While the molecular mechanisms underlying IPF pathogenesis are still elusive and controversial its incidence is constantly rising and is estimated at 5 million cases all over the world where 40.000 cases die every year. As regards the involvement of T lymphocytes in IPF, data are largely conflicting and support either a profibrotic or antifibrotic role of the former in pulmonary fibrosis. Nevertheless, most of the above studies investigated T cells as a whole, whereas the emerging novel subpopulations of effector and regulatory T cells may have antithetical actions in IPF, thus reconciling the incongruous findings. Such a subpopulation, the CD4+CD25+FOXP3+ Τ regulatory cells (Tregs), is essential for the control of the immunologic tolerance and the prevention of autoimmunity. Considering the central role of Tregs in immune regulation, we sought to explore Treg dynamics and function in IPF, by studying BAL and PB Tregs in normal donors and patients with IPF or other lung diseases. In addition, patients with collagen vascular diseases with pulmonary parenchymal involvement (CVD-IP) served as “positive” controls for Treg dysfunction, as these disorders are largely characterized by Treg defects.

PATIENTS & METHODS: Treg number,frequency and CXCR3 expression was assessed by 4-color flow cytometry in the peripheral blood (PB) and bronchoalveolar lavage (BAL) of healthy volunteers (HV, n=28), patients with IPF ( n=21), patients with CVD-IP (n=18) and other lung diseases besides IPF patients (non-IPF,n=35). Treg suppressor activity was assessed by proliferation and suppression assays of MACS-isolated PB and BAL Tregs after polyclonal stimulation with plate bound CD3/CD28 Dynabeads. The levels of cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-4 and IL-10 were measured in the supernatants of the proliferation assays described above by using the Human Th1/Th2 Cytokine cytometric bead array Kit, whereas TGF-β secretion by polyclonally stimulated Tregs was assessed by ELISA. The significance of the differences was assessed by one way ANOVA or paired Student’s t test as appropriate and the results are presented as mean ± SEM. Correlations were assessed with Spearmans rank test.

RESULTS: A twofold reduction in the percentage of Tregs was observed in the BAL of IPF patients, compared to nIPF and CVD-IP patients. Furthermore, although not statistically significant, the absolute Treg cell number/L in IPF was substantially lower than in nIPF and CVD-IP. In PB, patients with IPF showed significantly lower percentage of CD4+CD25+FOXP3+ Tregs compared to the rest of the groups. Similarly, the absolute number of Tregs in the PB of IPF patients was nearly the half of the respective in the PB of HV, nIPF and CVD-IP patients. Treg percentage and absolute count in either cellular compartment did not differ significantly among nIPF, CVD-IP patients and healthy volunteers. Treg percentage and absolute number in PB of 4 IPF patients remained unaltered before and after steroid administration and antioxidants for six months. Tregs from BAL as well as PB were considerably less efficient in suppressing autologous polyclonal T cell proliferative responses in IPF patients compared to HV and nIPF patients. Likewise, the suppressive capacity of Tregs from CVD-IP patients was up to three times lower, although not always statistically significant, compared to HV and nIPF patients. In contrast, both BAL and PB Tregs in CVD-IP exhibited comparable suppression to the IPF ones. Τhe determination of Treg-induced inhibition of IFN-γ and TNF-α production in the supernatants of proliferation assays, yielded comparable results with the in vitro inhibition of Teff proliferation, as BAL Tregs from IPF patients failed to adequately suppress IFN-γ, TNF-α and IL-4 secretion compared to those of HV and nIPF patients. Comparable CXCR3 levels were observed in PB CD4+ cells of IPF, nIPF and CVD-IP patients and HV. By contrast, CXCR3 expression on PB Tregs was increased in IPF compared to HV and nIPF patients, whereas CVD-IP patients had also higher, but not statistically significant, CXCR3 levels in PB Tregs than HV and nIPF. Conversely, in BAL, both Tregs and total CD4+ cells showed significantly reduced CXCR3 expression in IPF patients compared to nIPF patients. Consistent to the findings in PB Tregs, CXCR3 in CVD-IP BAL Tregs was equally expressed with IPF and quite lower than nIPF Tregs. CONCLUSIONS: In conclusion, the present study provides the first evidence of a local and systemic dysfunction of Tregs in IPF. Treg deficiency is severe, as Tregs are not only numerically deficient, but also of dysfunctional at the single cell level while the deficiency is more prominent in the lung tissue, implying a link between Treg impairment and pulmonary fibrosis. In addition, the strong correlation of the compromised Treg function in BAL with parameters of disease severity further supports this notion. Thus, Tregs emerge as the first regulatory T cell subpopulation that may contribute to the pathogenesis of IPF and render Tregs as candidate targets for a cell-based therapy of this incurable disease.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο όρος διάμεσες πνευμονοπάθειες περιλαμβάνει μια ετερογενή ομάδα διαταραχών στην οποία η πνευμονική ίνωση, αποτελεί κοινό παρονομαστή. Μία συχνά απαντώμενη στην κλινική πράξη διάμεση πνευμονοπάθεια είναι η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (IPF), η οποία στην πλειοψηφία των περιπτώσεων καταλήγει σε θάνατο του ασθενούς εντός 3-5 ετών από την αρχική διάγνωση. Η IPF αποτελεί σοβαρό θεραπευτικό πρόβλημα, καθώς ευθύνεται για περίπου 40.000 θανάτους ετησίως σε όλο τον κόσμο, ενώ η επίπτωσή της αυξάνεται συνεχώς σε παγκόσμια κλίμακα. Επιπλέον, η παθογένεση της IPF παραμένει ουσιαστικά άγνωστη, γεγονός που αντικατοπτρίζεται στα απογοητευτικά αποτελέσματα των τρεχουσών θεραπειών. Aρκετές ενδείξεις συνηγορούν στη συμμετοχή της αυτοανοσίας στην παθοφυσιολογία της IPF, ωστόσο η δράση των Τ λεμφοκυττάρων άλλοτε αναφέρεται ως προϊνωτική και άλλοτε ως αντιινωτική δημιουργώντας σύγχυση και καχυποψία της πλειοψηφίας των ερευνητών ως προς την βεβαιότητα της συμμετοχής του ανοσοποιητικού στη διαδικασία της πνευμονικής ίνωσης. Εν τούτοις τα έως τώρα δεδομένα βασίζονται σε πειραματικές προσεγγίσεις που χρησιμοποίησαν το σύνολο ή μόνο αδρές υποομάδες, όπως CD4+ και CD8+ Τ λεμφοκυττάρων. Η ταυτοποίηση και ο ακριβής χαρακτηρισμός μιας πληθώρας νέων λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών καθιστά επιτακτική την ανάγκη της επιμέρους μελέτης τους στην IPF. Ένας τέτοιος υποπληθυσμός είναι και αυτός των CD4+CD25+FOXP3+ Τ ρυθμιστικών κυττάρων (Τρυθ) που ρυθμίζουν την ανοσολογική ανοχή προστατεύουν από φαινόμενα αυτοανοσίας. Δεδομένου του κεντρικού ρόλου που διαδραματίζουν τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα στην ρύθμιση του ανοσοποιητικού καθώς και την πιθανή συμμετοχή του τελευταίου στην παθογένεια της πνεμονικής ίνωσης και ειδικότερα της IPF, η μελέτη αυτή είχε σαν σκοπό να κάνει μια ενδελεχή διερεύνηση της δυναμικής και της λειτουργίας των Τρυθ σε ασθενείς με διάμεσες πνευμονοπάθειες, μελετώντας τα Τρυθ από το αίμα και το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) υγιών εθελοντών, ασθενών με IPF και ασθενών με άλλες πνευμονοπάθειες. Επιπλέον οι διαταραχές των Τρυθ σε ασθενείς με νοσήματα του συνδετικού ιστού συνοδευόμενα από προσβολή του διάμεσου πνευμονικού ιστού αποτέλεσαν τη βάση σύγκρισης των ευρημάτων της ομάδας της IPF, προκειμένου να κατανοηθεί καλύτερα η σύνδεση του ρόλου των Τρυθ και της αυτοανοσίας με την παθοφυσιολογία της IPF.

ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Το ποσοστό, ο αριθμός των Tρυθ καθώς και η έκφραση του υποδοχέα CXCR3 μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής στο περιφερικό αίμα (ΠΑ) και βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση (IPF, n=21).Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν μια ομάδα υγιών εθελοντών (HV, n=28) και ασθενείς με διάφορες, μη διάμεσες, πνευμονοπάθειες (nIPF, n=35). Επίσης σαν “θετικός” μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ομάδα ασθενών με CVD-IP (CVD-IP, n=18), που είναι γνωστό πως παρουσιάζουν δυσλειτουργία των Τρυθ. Η λειτουργικότητα των Tρυθ αξιολογήθηκε με δοκιμασίες καταστολής και πολλαπλασιασμού μετά από πολυκλωνική διέγερση με CD3/CD28 σφαιρίδια, απομονωμένων με μαγνητικά σφαιρίδια CD4+CD25- και CD4+CD25high κυττάρων. Οι κυτταροκίνες IFN-γ, TNF-α, IL-4 και IL-10 προσδιορίσθηκαν στα υπερκείμενα των δοκιμασιών καταστολής με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας την τεχνική CBA (Cytometric Bead Array), ενώ η έκκριση TGF-β από διεγερμένα Τρυθ με ELISA. Η σημαντικότητα των διαφορών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση διακύμανσης μονής κατεύθυνσης (One-Way ANOVA) η το κατα ζεύγη Student’s t τεστ, ενώ η συσχέτιση των παραμέτρων της αναπνευστικής λειτουργίας με τον αριθμό και τη λειτουργικότητα των Τρυθ έγινε με το Spearmans rank test.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Το ποσοστό των CD4+CD25+FOXP3+ κυττάρων (Τρυθ) στο BAL των ασθενών με IPF ήταν υποδιπλάσιο σε σύγκριση με αυτό των nIPF και CVD-IP ασθενών. Επιπλέον ο απόλυτος αριθμός (κύτταρα/μL) των Τρυθ κυττάρων στο BAL των ασθενών με IPF ήταν σημαντικά μικρότερος συγκριτικά με αυτόν των nIPF και CVD-IP ασθενών. Παρομοίως, χαμηλότερο ήταν και το ποσοστό των Τρυθ στο αίμα των ασθενών με IPF συγκριτικά με όλες τις υπόλοιπες ομάδες ενώ και ο απόλυτος αριθμός τους ήταν σχεδόν ο μισός του αντίστοιχου των HV, nIPF και CVD-IP ασθενών. Τόσο το ποσοστό όσο και ο απόλυτος αριθμός των Τρυθ κυττάρων δεν διέφερε ουσιαστικά μεταξύ των HV, nIPF και CVD-IP ασθενών, τόσο στο αίμα, όσο και στο BAL. Επιπλέον το ποσοστό και ο απόλυτος αριθμός των Τρυθ δε μεταβλήθηκαν σε 4 ασθενείς με IPF, οι οποίοι έλαβαν θεραπεία με στεροειδή και αντιοξειδωτικά για έξι μήνες. Τα Τρυθ τόσο στο BAL όσο και στο αίμα των ασθενών με IPF ανεπαρκούσαν να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό αυτόλογων πολυκλωνικών Τ κυττάρων σε σύγκριση με αυτά των HV και των nIPF. Αν και όχι πάντα στατιστικά σημαντική, εν τούτοις η κατασταλτική ικανότητα των Τρυθ των ασθενών με CVD-IP ήταν έως και 3 φορές μικρότερη συγκριτικά με αυτήν των HV και των nIPF ενώ αντίθετα ήταν συγκρίσιμη με αυτή των ασθενών με IPF. Η προκαλούμενη από τα Τρυθ αναστολή της έκκρισης της IFN-γ,του TNF-α και της IL-4 ήταν σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των δοκιμασιών καταστολής του πολλαπλασιασμού των Τ δραστικών κυττάρων και κυρίως στο BAL, όπου τα Τρυθ ασθενών με IPF απέτυχαν να καταστείλουν την παραγωγή IFN-γ, TNF-α και IL-4 από ενεργοποιημένα Τ δραστικά κύτταρα, σε αντίθεση με τα Τρυθ των HV και των nIPF. Τέλος, συγκρίσιμα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα CXCR3 στα CD4+ του αίματος των ασθενών με IPF με τα αντίστοιχα των άλλων ομάδων της μελέτης. Αντίθετα η έκφραση του CXCR3 στα Τρυθ του αίματος στην IPF ήταν αυξημένη συγκριτικά με αυτή των HV και nIPF ενώ οι ασθενείς με CVD-IP είχαν επίσης υψηλά, αν και όχι στατιστικά σημαντικά, επίπεδα CXCR3 στα Τρυθ του αίματος. Αντίστροφα, στο BAL τόσο τα Τρυθ όσο και τα CD4+ κύτταρα είχαν σημαντικά μειωμένη έκφραση CXCR3 στους ασθενείς με IPF σε σύγκριση με τους nIPF. Επίσης, σε συμφωνία με τα ευρήματα του περιφερικού αίματος, οι ασθενείς με CVD-IP εμφάνιζαν χαμηλότερη έκφραση CXCR3 στα Τρυθ του BAL συγκριτικά με τους nIPF και παρόμοια με αυτή των IPF ασθενών.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ:

Συμπερασματικά, η παρούσα εργασία καταδεικνύει για πρώτη φορά μια τοπική αλλά και συστηματική δυσλειτουργία των Τρυθ στην IPF. Η ανεπάρκεια των Τρυθ είναι εκσεσημασμένη, αφού τα Τρυθ υπολείπονται τόσο αριθμητικά, όσο και λειτουργικά, ενώ είναι πιο έκδηλη στον πνευμονικό ιστό, υποδηλώνοντας αιτιολογική σύνδεση της ανεπάρκειας των Τρυθ με την τοπική διεργασία της ίνωσης, υπόθεση που ενισχύεται περαιτέρω από την ισχυρή συσχέτιση της δυσλειτουργίας των Τρυθ του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος με τη βαρύτητα της νόσου. Τα ευρήματα της μελέτης μας αναδεικνύουν τα Τρυθ ως τον πρώτο ρυθμιστικό λεμφοκυτταρικό υποπληθυσμό με πιθανή συμμετοχή στη παθογένεση της IPF, καθιστώντας τα ως υποψήφιους στόχους κυτταρικής θεραπείας στην ανίατη αυτή νόσο.