Αξιολόγηση εναλλακτικών τεχνικών για την ανάπτυξη νέων και βελτιωμένων μεθόδων προσδιορισμού φαρμάκων σε πλάσμα με την τεχνική της δίδυμης φασματομετρίας μαζών

Abstract

In the current study, alternative techniques of plasma samples pretreatment and analysis were examined, in order for new quantitative determination methods of pharmaceutical compounds to be developed by employing LC-MS/MS technique. The goal of the study was the increase of sensitivity of the analytical method and the reduction of the total time of the analytical procedure. All three general steps of a typical analytical method were studied, namely sample pretreatment, chromatographic separation and spectrometric determination. Alternative techniques application was examined for all of the steps mentioned above, aiming at the development of improved analytical methods. All methods developed were based on 96 well format profiles combined with the employment of two robotic liquid handling systems. In the first section of the study a method for the quantitative simultaneous determination of simvastatin and its hydroxyl-metabolite in human plasma by ESIMS/ MS was developed and fully validated. Pretreatment procedure employed 300 μL of plasma sample including a combined technique of ACN protein precipitation followed by a two-step extraction with MTBE. Protein precipitation step resulted in significant sensitivity increase as well as matrix effect limitation. Two-step extraction increased sensitivity as well compared to conventional one-step LLE allowing the quantitation of samples with a QL of 0.100 ng/mL. Combination of the two pretreatment techniques allowed the employment of the advantageous 96 format. The method developed included the shortest reported chromatographic runtime (1.9 min) and was successfully applied to the analysis of plasma samples of a bioequivalence study of a simvastatin formulation (40 mg). The current preatreatment protocol developed was proposed as a general model for analytical methods with significantly low quantitation limits, combined with high degree of high throughput maintenance for the whole procedure. In the second section of the study, ESI and APCI ion sources were evaluated and compared for anastrozole LC-MS/MS determination in plasma samples. The two sources application was studied in terms of sensitivity and matrix effect. In addition, Declustering Potential and Collision Energy influence in anastrozole determination sensitivity was evaluated and compared. As far as sample pretreatment is concerned, a protocol of ACN protein precipitation combined with an LLE step with MTBE was applied. Method sensitivity was highly increased due to the current protocol application, allowing the analysis of samples with a QL of 0.100 n/mL. APCIMS/ MS method developed included the shortest chromatographic run time reported (1.6 min) as well as the lowest plasma volume. Finally, analytical method was fully validated and applied to the bioequivalence study between two anastrozole formulations (1 mg). In the final section of the study, HILIC was compared to RPLC for the ESI-MS/MS determination of pharmaceutical compounds of medium-high polarity in plasma samples. The two techniques were compared in terms of sensitivity as well as high throughput and simplicity of pretreatment protocols. Retention mechanism of donepezil, cetirizine and loratadin was studied under the two chromatographic profiles. Next, two similar LLE methods for the quantitative determination of donepezil was developed, employing two different chromatographic protocols of HILIC and RPLC. The two methods were compared in terms of sensitivity. In addition, combination of direct injection after major sample preparation techniques (LLE, SPE and PP) with HILIC and RPLC ESI-MS/MS was evaluated. Compatibility of HILIC compared to RPLC-MS/MS was thus proven, in terms of sensitivity and high throughput of sample pretreatment procedure. Finally, the current study contributed to the broadening of the so far limited range of analyzable compounds with HILIC-MS/MS from highly polar to pharmaceutical compounds of medium polarity as well.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν εναλλακτικές τεχνικές κατεργασίας και ανάλυσης δειγμάτων πλάσματος για την ανάπτυξη νέων, βελτιωμένων μεθόδων προσδιορισμού φαρμακευτικών ουσιών με χρήση υγροχρωματογραφίας συζευγμένης με δίδυμη φασματομετρία μαζών σε σειρά (LC-MS/MS). Ο στόχος της μελέτης ήταν η αύξηση της ευαισθησίας των αναλυτικών μεθόδων με ταυτόχρονη μείωση του συνολικού χρόνου της αναλυτικής διαδικασίας. Μελετήθηκαν και τα τρία γενικά στάδια μιας τυπικής αναλυτικής μεθόδου, η κατεργασία, ο χρωματογραφικός διαχωρισμός και ο φασματομετρικός προσδιορισμός και εξετάστηκε η εφαρμογή εναλλακτικών τεχνικών στα στάδια αυτά με σκοπό την ανάπτυξη βελτιωμένων αναλυτικών μεθόδων. Όλες οι αναπτυχθείσες μέθοδοι περιλάμβαναν χρήση διάταξης 96 θέσεων σε συνδυασμό με την χρήση δύο ρομποτικών συστημάτων διαχείρισης υγρών δειγμάτων και ανάλυση με την τεχνική LC-MS/MS. Στο πρώτο σκέλος της διατριβής αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε πλήρως μέθοδος προσδιορισμού της σιμβαστατίνης και του υδροξυ-μεταβολίτη της σε ανθρώπινο πλάσμα με χρήση πηγής ιοντισμού Ηλεκτροψεκασμού (Electrospray Ionization, ESI) για το φασματόμετρο μαζών. Η κατεργασία έγινε σε 300 μL πλάσματος με συνδυασμένη τεχνική κατακρήμνισης πρωτεϊνών με ACN και υγρό-υγρό εκχύλισης δύο σταδίων (two-step extraction) με οργανικό διαλύτη MTBE. Το στάδιο της κατακρήμνισης πρωτεϊνών οδήγησε σε σημαντική αύξηση της ευαισθησίας, καθώς επίσης και περιορισμό της επίδρασης μητρικού φαινομένου (matrix effect). Παράλληλα το πρωτόκολλο εκχύλισης σε δύο διαδοχικά στάδια ολοκληρώθηκε με μεταφορά των εκχυλισμάτων από κάθε στάδιο σε μια κοινή πλάκα 96 θέσεων. Το πρωτόκολλο αυτό οδήγησε επίσης σε αύξηση της ευαισθησίας σε σχέση με την εκχύλιση ενός σταδίου. Ο συνδυασμός της κατακρήμνισης πρωτεϊνών με την υγρό- υγρό εκχύλιση δύο σταδίων επέτρεψε την υιοθέτηση της προνομιούχου διάταξης 96 θέσεων σε σχέση με τη συμβατική κατεργασία εντός δοκιμαστικών σωλήνων και την επίτευξη ιδιαίτερα χαμηλού ορίου ποσοτικοποίησης (0,1 ng/mL). Η αναπτυχθείσα μέθοδος περιλάμβανε το μικρότερο βιβλιογραφικά δημοσιευμένο χρωματογραφικό χρόνο ανάλυσης (1,9 min) και εφαρμόστηκε επιτυχώς σε μελέτη βιοϊσοδυναμίας σκευάσματος σιμβαστατίνης των 40 mg. Το συγκεκριμένο πρωτόκολλο κατεργασίας προτάθηκε ως γενικό μοντέλο για αναλυτικές μεθόδους με ιδιαίτερα χαμηλά όρια ποσοτικοποίησης με σκοπό την επίτευξη υψηλής ευαισθησίας σε συνδυασμό με τη διατήρηση της αυτοματοποίησης και της υψηλής ταχύτητας της συνολικής διαδικασίας. Στο δεύτερο σκέλος της διατριβής, συγκρίθηκε αναλυτικά η χρήση πηγής ESI με αυτή της πηγής Χημικού Ιοντισμού σε συνθήκες Ατμοσφαιρικής Πίεσης για τον προσδιορισμό αναστροζόλης σε πλάσμα με τεχνική LC-MS/MS. Μελετήθηκε η εφαρμογή των δύο πηγών ως προς την ευαισθησία και την επίδραση του μητρικού φαινομένου. Επίσης, μελετήθηκε και συγκρίθηκε η επίδραση του Δυναμικού Αποσύζευξης (Declustering Potential, DP) και του Δυναμικού Σύγκρουσης (Collision Energy, CE) με τη χρήση των δύο διαφορετικών πηγών ιοντισμού στην ευαισθησία του φασματομέτρου μαζών για τον προσδιορισμό της αναστροζόλης και του εσωτερικού προτύπου. Ως προς την κατεργασία των δειγμάτων, εφαρμόστηκε πρωτόκολλο κατεργασίας με συνδυασμό κατακρήμνισης πρωτεϊνών με ACN και υγρό-υγρό εκχύλιση με οργανικό διαλύτη MTBE. Η ευαισθησία της μεθόδου αυξήθηκε σημαντικά χάρη στην εφαρμογή του συγκεκριμένου πρωτοκόλλου κατεργασίας επιτρέποντας την επίτευξη ιδιαίτερα χαμηλού ορίου ποσοτικοποίησης (0,1 ng/mL). Η τελική μέθοδος που αναπτύχθηκε με χρήση πηγής APCI περιλάμβανε τη χρήση του μικρότερου βιβλιογραφικά δημοσιευμένου όγκου πλάσματος (190 μL) και του μικρότερου χρωματογραφικού χρόνου ανάλυσης (1,6 min). Τέλος, η μέθοδος επικυρώθηκε πλήρως και εφαρμόστηκε στη μελέτη βιοϊσοδυναμίας μεταξύ δύο σκευασμάτων αναστροζόλης 1 mg. ..........................................................................................................................................................................................................