Ανοσοϊστοχημική μελέτη της σχέσης των υποδοχέων οιστρογόνων ER-α με την αγγειογένεση σε αιμαγγειωματοειδή κοκκιώματα των ούλων

Abstract

Objectives: To investigate the expression of estrogen receptor (ER-a), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), and endoglin (CD 105) in human pyogenic granulomas. Previous studies have demonstrated increased expression of estrogen receptors and detectable enhancement of eNOS activity, while CD 105 is a proliferation-associated and hypoxia-inducible protein predominantly expressed by angiogenic endothelial cells (ECs). Methods: Ninety-three tumors, mostly from the gingival, were included in the study. Sixteen tumors were classified as pregnancy tumors and seventeen as fibrosing (mature) pyogenic granulomas. In total, three sub-groups (pyogenic granulomas, fibrosing pyoegnic granulomas, pregnancy tumors) were formed. The lesions were retrieved from the files (1974-2002) of the Department of Oral Pathology and Medicine, Dental School of the National and Kapodistrian University of Athens. All materials were previously fixed in 10% neutral buffered formalin solution (24-48h), dehydrated by graded alcohol, embedded in paraffin and prepared for immunohistochemistry. The specimens were processed for immunohistochemistry to detect and compare the expression of the monoclonal antibodies anti- ER-a (Novocastra Laboratories Ltd. clone 6F11), anti- CD105 (Innovex Biosciences, clone 8E11) and the polyclonal antibody anti- eNOS (Assay designs, catalog no: 905-386). Proteolytic digestion for ER-a, eNOS and CD105 of the sections was performed with citric sodium solution (2,1% citric sodium, pH=6). Optimal dilution of the antibodies were 1:50. Immunohistochemical expression of ER-a, eNOS and CD 105 was quantified by computerized image analysis with a semi-automated system. Results: Weak expression of ER-a was seen in 6 of 93 specimens. Abundant and well-defined expression of CD 105 and eNOS were seen in the endothelial cells of lesional capillaries. Statistical analysis showed no significant correlation between the expression of ER-a and CD105 or eNOS. There was also, no significant correlation between CD105 and eNOS in each subgroup, or in relation to the location of the lesions (gingival-other locations). The expression of CD 105 and eNOS in fibrosing pyogenic granulomas was lower (p<0.05) than in pyogenic granulomas. Conclusions: It is suggested that there is no direct correlation between the expression of ER-a, eNOs, and CD105 in the inflammatory angiogenic process in pyogenic granulomas, but there is evidence that eNOS and CD105 may be involved in the angiogenic mechanism. The absence of correlation between eNOS and CD105 may be explained by the different angiogenic pathways those molecules are involved. The role of other variables, such as the level of circulating hormones and the role of macrophages, need further research.

Σκοπός: Η παρούσα ερευνητική μελέτη διερευνά την σχέση των υποδοχέων οιστρογόνων ER-α, με τις πρωτεΐνες - αγγειογενετικούς δείκτες eNOS και CD105 σε αιμαγγειωματοειδή κοκκιώματα (ΑΚ) των ούλων και επουλίδες της κύησης (ΕΚ). Προηγούμενες έρευνες έχουν δείξει άμεση ενεργοποίηση της eNOS από τα οιστρογόνα, ενώ η CD105 είναι μία πρωτεΐνη που εκφράζεται κυρίως σε πολλαπλασιαζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs), και η συγκέντρωση της αυξάνεται σε συνθήκες υποξίας. Υλικό-Μέθοδος: Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 77 ΑΚ, από τα οποία τα 17 ήταν σε φάση ωρίμανσης (ΑΚ-ΩΡ), και 16 ΕΚ. Τα ιστοτεμάχια της μελέτης είχαν εξετασθεί ιστοπαθολογικά στο Εργαστήριο της Στοματολογίας του Οδοντιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Αθηνών κατά την χρονική περίοδο 1974-2002. Συνολικά δημιουργήθηκαν τρεις υποομάδες: ΑΚ, ΑΚ-ΩΡ, ΕΚ. Όλες οι παραπάνω βιοψίες (1140 περιπτώσεις) εξετάσθηκαν μικροσκοπικά και επιλέχθηκαν εκείνες (93 περιπτώσεις) που εμφάνιζαν ιστολογική εικόνα αντιπροσωπευτική της κάθε υποομάδας οντοτήτων, σύμφωνα με τα καθιερωμένα ιστολογικά κριτήρια. Πρόσθετα κριτήρια επιλογής ήταν η ύπαρξη επαρκούς ιστού και η παραμονή του σε μονιμοποιητικό διάλυμα φορμόλης 10% για χρόνο 24-48 ώρες. Ακολούθησε η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση των μονοκλωνικών αντισωμάτων anti- ER-a (Novocastra Laboratories Ltd, clone 6F11), anti- CD105 (Innovex Biosciences, clone 8E11), και του πολυκλωνικού αντισώματος έναντι της eNOS (Assay designs, catalog no: 905-386). Για την αποκάλυψη των αντιγονικών επιτόπων ER-α, eNOS και CD105 οι τομές τοποθετήθηκαν σε διάλυμα κιτρικού οξέος (pΗ=6) και στη συνέχεια σε χύτρα ατμού για 5’( θερμοκρασία και πίεση). Η βέλτιστη αραίωση των πρωτογενών αντισωμάτων προσδιορίστηκε σε 1:50. Η ποσοτική μέτρηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης των ER-a, της eNOS και της CD105 πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή ημιαυτόματου συστήματος ανάλυσης εικόνας. Αποτελέσματα: Ασθενής πυρηνική ανοσοαντίδραση του ER-α παρατηρήθηκε σε 6 από τις 93 περιπτώσεις. eNOS(+) κύτταρα παρατηρήθηκαν σε 92 από τις 93 περιπτώσεις (98,92%), ενώ CD105(+) κύτταρα βρέθηκαν και στις 93 περιπτώσεις του υλικού της μελέτης. Η ένταση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης σε όλες τις περιπτώσεις ήταν μέτρια. Η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε καμία σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του ER-a και της eNOS ή της CD105. Δεν υπήρξε επίσης, καμία σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση της eNOS και της CD105 σε κάθε υποομάδα ή σε σχέση με την εντόπιση των βλαβών στο στόμα. Η έκφραση της eNOS και της CD105 στα ΑΚ-ΩΡ ήταν μειωμένη (p<0.05) σε σχέση με την αντίστοιχη έκφραση στα ΑΚ. Η αύξηση της ηλικίας φάνηκε να συνδέεται με αυξημένους κατά 9% ανά δεκαετία eNOS αγγειακούς χώρους και ποσοστά % eNOS. Συμπεράσματα: Από τα αποτελέσματα της μελέτης πιθανολογείται ότι το αγγειογενετικό μονοπάτι ER-a→ eNOS→ CD105 δεν εμπλέκεται εμφανώς στην παθογένεση των ΑΚ και ΕΚ. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι τα μόρια αυτά εμπλέκονται στην αγγειογενετική αλληλουχία μέσω διαφορετικών οδών. Η έντονη και καθολική έκφραση των πρωτεϊνών eNOS και CD105 στους πυρήνες των ECs των βλαβών που εξετάστηκαν υποδηλώνει την συμμετοχή των μορίων αυτών στον φλεγμονώδη αγγειογενετικό μηχανισμό των ΑΚ/ΕΚ. Ο ρόλος άλλων παραμέτρων, όπως τα επίπεδα των κυκλοφορούντων ορμονών καθώς και ο ρόλος των μακροφάγων, χρειάζονται περισσότερη διερεύνηση.