Διερεύνηση συσχετισμού των ελλείψεων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του σπέρματος με την ανδρική υπογονιμότητα

Abstract

One of the most common causes of subfertility include sperm-relates deficiencies (concerning the concentration, motility and morphology of spermatozoa), according to estimations of the World Health Organization (WHO). The power of semen parameter analysis in predicting future fertility is questioned in the past few years. Yet, new molecular tests, based on measurements of sperm DNA quality, aim at the successful treatment of male infertile patients. The mitochondrial genome of sperm has also been proposed as a marker of sperm health. Several studies have examined the correlation of mtDNA deletions and sperm dysfunction, but have produced contradictory results. Here we show that PCR slippage (results in the formation of pseudo-deletions) and primer miss-match to nuclear DNA may lead to overestimates in the frequency of deletions. We propose a molecular mechanism for the explanation of the in vitro formation of pseudo-deletions that involves the presence of direct repeats. These data implies that inconsistencies in the literature are due to technical inaccuracies of used methods. Our investigation resolves this issue and gives strong negative correlation between the proportion of the "common" deletion and sperm motility. In addition, we identify two novel deletions, of 5955 and 5852 bp of mtDNA, with significantly higher ratio in the spermatozoa with poor motility and diminished fertility than those with good motility and fertility. Furthermore, for the first time, we present data which reinforce the hypothesis for a negative correlation between the mtDNA "common" deletion and fertilization efficiency of spermatozoa. Our investigation points to a way for the construction of a molecular test for the estimation of sperm integrity and fertility potential, even in cases of idiopathic infertility.

Σύμφωνα με εκτιμήσεις του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO), σημαντικό ποσοστό δυσκολιών σύλληψης οφείλεται σε παθολογία του σπέρματος. Κατά πάγια τακτική, ως δείκτης της ανδρικής υπογονιμότητας χρησιμοποιείται το σπερμοδιάγραμμα. Τα τελευταία χρόνια επιχειρείται μια προσπάθεια σχεδιασμού μοριακών-διαγνωστικών ελέγχων (test), για την πρόγνωση της γονιμότητας ενός άνδρα. H παρούσα μελέτη φιλοδοξεί να συμβάλει προς αυτή την κατεύθυνση μέσω της διερεύνησης της εμπλοκής των μιτοχονδρίων στην ανδρική υπογονιμότητα, και πιο συγκεκριμένα διερευνά τη σχέση μεταξύ των ελλείψεων του mtDNA και ανδρικής υπογονιμότητας. Σε γενικές γραμμές, τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα, αν και υποδεικνύουν την ύπαρξη μιας σχέσης μεταξύ των ελλείψεων μεγάλης κλίμακας και της χαμηλής ποιότητας του σπέρματος, είναι ασαφή. Βιβλιογραφικές μελέτες για την εμπλοκή της «κοινής» έλλειψης των 4977-bp στη δυσλειτουργία των σπερματοζωαρίων οδήγησαν σε αντικρουόμενα αποτελέσματα. Κατά την παρούσα μελέτη αποκαλύφθηκαν σφάλματα στις χρησιμοποιούμενες μεθοδολογίες, τα οποία μπορούν να οδηγήσουν στην εξαγωγή λανθασμένων και παραπλανητικών συμπερασμάτων, και προτάθηκαν λύσεις για πιο αξιόπιστα αποτελέσματα. Με τις προτεινόμενες μεθόδους αποσαφηνίζεται η εικόνα και παρέχονται ακριβείς πληροφορίες για την αρνητική συσχέτιση της έλλειψης των 4977-bp με την κινητικότητα του σπέρματος, ενώ εντοπίζει για πρώτη φορά αρνητική σχέση μεταξύ της παρουσίας της έλλειψης και της ικανότητας των σπερματοζωαρίων να γονιμοποιήσουν. Δευτερογενώς, ανιχνεύθηκαν και χαρακτηρίστηκαν δύο νέες ελλείψεις με αυξημένη συχνότητα στους υπογόνιμους άνδρες. Τέλος διαπιστώθηκε η πιθανότητα τεχνητής δημιουργίας ελλείψεων κατά την διάρκεια της PCR. Ο προτεινόμενος μηχανισμός για την in vitro δημιουργία των «ψευδο-ελλείψεων» προϋποθέτει την παρουσία επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών στα άκρα των περιοχών που απομακρύνονται. Η προτεινόμενη πειραματική διαδικασία είναι ασφαλής, εύκολη και οικονομική και θα μπορούσε να αποτελέσει τυποποιημένο μοριακό-εργαλείο για την πρόβλεψη της ικανότητας ενός άνδρα να γονιμοποιήσει, ακόμα και σε περιπτώσεις ιδιοπαθούς (αγνώστου αιτιολογίας) υπογονιμότητας.