Η συμβολή της βιοτεχνολογίας (αλληλουχία γονιδίων) στον προσδιορισμό των γονοτύπων και στην ανάδειξη μεταλλάξεων του ιού της ηπατίτιδας Β μετά από αντι-ική θεραπεία

Abstract

The purpose of the study was to use bi-directional PCR sequencing, in order to detect resistance mutations to lamivudine and adefovir. Using PCR sequencing assay, all mutations in the region of reverse transcriptase of the A-E domains of HBV polymerase could be identified as well as mutations correlated to drug resistance and mutations not correlated to drug resistance. One hundred patients with chronic HBeAg (–) chronic hepatitis B participated in the study and were initially treated with lamivudine. At baseline and every 3 months thereafter, biochemical, aminotransferase levels and viral load were examined. The results of the present study showed that the mean time of resistance to lamivudine treatment was 34.8±17.73 months and that the elevation of viral load from nadir and ALT showed a high deviation among patients with a mean ALT level of 165.5±247.49 and mean HBV DNA 26.3±76.11 (x106 copies /ml). Concerning resistance mutations under the pressure of lamivudine, the following was observed: 3 patients had a mutation in position 180, 66 in 180+204, 30 in 204 and 1 patient in position 173+204. Furthermore, it was found that levels of HBV DNA tended to be a significant marker of resistance time prediction (<0.007), that is lower baseline levels of HBV DNA were correlated with longer time of antiviral resistance to lamivudine treatment (Beta= –0.203). Using the correlation co-efficient, ALT and AST levels were found to have a significant correlation with time of resistance (r=0.621, p<0.0001). Ninety-three/100 patients with resistance to lamivudine were then treated with adefovir as a rescue therapy, in 75 of them adefovir was added to lamivudine and in 11 adefovir was given as monotherapy. In the remaining 9 patients, adefovir and entecavir were given and in 5 more, adefovir was changed to entecavir because of partial response to adefovir. In conclusion, our results showed that genotypic analysis defines the presence of antiviral resistance to the specific drug used for the treatment of chronic hepatitis B, during the time of virologic/biochemical breakthrough, discriminating resistance to partial response to treatment or non-adherence to treatment. Furthermore, our findings support the use of a sensitive assay such as PCR sequencing in detecting both primary and compensatory emerging resistance mutations to the initial therapy so that the drugs used as a rescue therapy do not show cross-resistance or develop multidrug resistance.

Η χρησιμοποίηση μιας ευαίσθητης τεχνικής, της διπλής κατεύθυνσης (bi-directional) PCR sequencing, απετέλεσε και τον σκοπό της παρούσας μελέτης με απώτερο σκοπό την εντόπιση των μεταλλάξεων αντίστασης στη λαμιβουντίνη και την αδεφοβίρη. Με την τεχνική αυτή ήταν δυνατή η ανίχνευση όλων των μεταλλάξεων της περιοχής της ανάστροφης τρανσκρυπτάσης, στις περιοχές Α-Ε της HBV πολυμεράσης. Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 100 ασθενείς με χρόνια HBeAg(-) ηπατίτιδα Β, οι οποίοι υποβλήθηκαν αρχικά σε θεραπεία με λαμιβουντίνη. Τα ευρήματα της μελέτης έδειξαν ότι ο μέσος χρόνος εμφάνισης αντίστασης των ασθενών στην λαμιβουντίνη ήταν 34.84±17.73 μήνες και η αύξηση του ιικού φορτίου και των ΑLT από το nadir, εμφάνιζαν μεγάλες διακυμάνσεις μεταξύ των ασθενών: μέση τιμή ALT 165.59±247.494 και μέση τιμή HBV DNA (x106 copies/ml) 26.30±76.11. Όσον αφορά τις μεταλλάξεις υπό την πίεση της λαμιβουντίνης, διαπιστώθηκαν τα εξής: 3 ασθενείς είχαν μετάλλαξη στη θέση 180, 66 ασθενείς είχαν μετάλλαξη στη θέση 180+204, 30 ασθενείς είχαν μετάλλαξη στη θέση 204, 1 ασθενής είχε μετάλλαξη στη θέση 173+204. Επίσης διαπιστώθηκε ότι μόνον οι τιμές του HBV DNA είχαν την τάση να είναι στατιστικά σημαντικός δείκτης πρόβλεψης για τον χρόνο εμφάνισης αντίστασης (p<0,07), έτσι ώστε οι χαμηλότερες τιμές του ιικού φορτίου συνδυάζονταν με μεγαλύτερο χρόνο μέχρι την εμφάνιση αντοχής στη θεραπευτική αγωγή (Beta= -0,203). Ο έλεγχος της κανονικότητας της κατανομής της ALT, AST, του HBV DNA και του χρόνου αντίστασης έδειξε ότι υπήρχε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μόνον μεταξύ της ALT και της AST (r=0,621 με p<0,0001). Οι 93 από τους 100 ασθενείς με αντίσταση στη λαμιβουντίνη, υποβλήθηκαν σε θεραπεία διάσωσης με αδεφοβίρη. Από αυτούς, 75 έλαβαν λαμιβουντίνη και αδεφοβίρη και 11 μόνο αδεφοβίρη. Σε 9 ασθενείς χορηγήθηκε αδεφοβίρη και εντεκαβίρη και σε 5 ασθενείς χορηγήθηκε μετά την αδεφοβίρη, εντεκαβίρη, λόγω μερικής απάντησης στην αδεφοβίρη. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η γονοτυπική ανάλυση επιβεβαιώνει την παρουσία ιικής αντοχής στο χορηγούμενο φάρμακο στις περιπτώσεις εμφάνισης ιολογικής ή/και βιοχημικής διαφυγής κατά τη διάρκεια θεραπείας για χρόνια ηπατίτιδα Β. Επιπλέον ενισχύεται η άποψη της χρήσης τεχνικών, όπως είναι η PCR sequencing, για τον προσδιορισμό των αναδυόμενων μεταλλάξεων ώστε στη συνέχεια να χρησιμοποιούνται φάρμακα τα οποία δεν παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντίσταση με το αρχικό φάρμακo ή και να αποφεύγεται η αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα.