Μοριακή επιδημιολογία ρικετσιώσεων

Abstract

Introduction: Rickettsioses are caused by species of Rickettsia, a genus comprising organisms characterized by their strictly intracellular location and their association with arthropods. There are three major groups of Rickettsia: a) the typhus group, where Rickettsia typhi, Rickettsia prowazekii and Rickettsia Canada belong, b) the spotted fever group where more than 20 Rickettsiae belong such as R. rickettsia, R. conori, R. akari, R. australis, R. Helvetica, R. slovaca, R. massiliae, R. rhipicephali, R. aesclimannii, R. mongolotimonae and c) the unclassified group where R. bellii and many species of R. endosymbiont belong. The rickettsioses are widely present in most of the European countries, former Soviet Union, Africa and in middle East. In Greece cases of spotted fever and typhus have been reported with rickettsiae being identified in both humans samples and ticks. Aim: The aim of this study was to identify rickettsiae species in patients and ticks from Northern Greece in order not only to study the prevalence of the disease but also to genetically characterize them and classify them taxonomically. Moreover, we sought to perform a complete molecular study of the disease in Greece with a view to compare our rickettsiae species with the previously identified ones worldwide. Finally, we included serological analyses in our study protocol in order to identify IgG και IgM antibodies against rickettsiae species. Materials and Methods: We studied a) 342 serological samples from patients with clinically suspected rickettsiosis, b) 31 whole blood samples from patients with clinically suspected rickettsiosis and c) 2.337 ticks collected from all prefectures of Northern Greece. We applied molecular and serological methods of analysis. For serological analysis we used the indirect microimmunofluorescence serologic typing test. In whole blood samples three different protocols of PCR were applied. The ticks were divided according to their specie, gene, developmental stage and origin. The DNA from ticks was isolated to perform polymerase chain reaction (PCR) analysis. From the serological analysis on 315 patients with clinically suspected rickettsioses we found that 17,1% of our patients had recent infection (4 definite, 38 probable, 12 possible), 90,7% from spotted fever group rickettsia and 9,3% from typhus group rickettsia (p< 0.001). We also found that 45,7% of our patients had previous infection 57,6% from spotted fever group rickettsia and 42,4% from typhus group rickettsia. Molecular analysis of clinical samples from patients with suspected rickettsiosis was negative. Regarding the studies on the isolated ticks, we found three groups of Rhipicephalus ticks and two groups of I. gibbosus positive for rickettsiae. The first group of Rh. turanicus ticks had been collected in 2004 from Metochi village in Serres prefecture. The second group of Rh. bursa ticks had been collected in 2006 from Lithotopos village, again in Serres prefecture, and the third group of Rh. bursa ticks had been collected in 2006 from Galatista village, in Chalkidiki prefecture. The two groups of I. gibbosus ticks were collected in 2005 from Panagitsa village in Pella prefecture. The identified nucleotide sequence was the same for the positive ticks from Galatista and Lithotopos and revealed that R. slovaca was the identified rickettsia. A completely different nucleotide sequence was identified from Metochi in Serres which belonged to R. massiliae. The sequence analysis of the PCR product from the I. gibbosus infected ticks showed that they were contaminated by R. endosymbiont of Haemaphysalis sulcata. Conclusions: The infection rate of ticks with pathogenic rickettsiae was relatively low (0,12%) in northern Greece, but there are some endemic areas (in Chalkidiki and Serres prefectures). It is apparent that in northern Greece the following pathogenic rickettsia species are present: R. conorii, R. massiliae, R. slovaca. From previous studies in other regions of Greece, it is obvious that both Spotted Fever group and Typhus group rickettsiae are widely distributed in Greece. Specifically, from the Spotted Fever group the following pathogenic rickettsia species are present in Greece: R. conorii, R. massiliae, R. slovaca, R. mongolotimonae, R. rhipicephali, and R. aeschlimannii. From Typhus group current evidence supports the presence of R. typhi.

Οι ρικέτσιες είναι ενδοκυττάρια παράσιτα, ανήκουν στο γένος Rickettsia της οικογένειας Rickettsiaceae και μεταδίδονται στον άνθρωπο με διάφορα αρθρόποδα, προκαλώντας λοιμώδη νοσήματα με παρόμοια κλινική εικόνα τις ρικετσιώσεις. Διακρίνονται 3 ομάδες: α) Η ομάδα του Εξανθηματικού Τύφου (typhus group, TG) στην οποία περιλαμβάνονται οι R. typhi, R. prowazekii και η R. canada. β) Η ομάδα του Κηλιδοβλατιδώδους Πυρετού (spotted fever group, SFG) στην οποία περιλαμβάνονται περίπου 20 είδη όπως οι R. rickettsia, R. conorii, R. akari, R. australis, R. helvetica, R. slovaca, R. massiliae, R. rhipicephali, R. aesclimannii, R. mongolotimonae. γ) Η ομάδα των αταξινόμητων ρικετσιών η οποία περιλαμβάνει τη R. bellii καθώς και διάφορα είδη R. Endosymbiont. Οι ρικετσιώσεις είναι ευρύτατα διαδεδομένες σχεδόν σε ολόκληρη την Ευρώπη, την Πρώην Σοβιετική Ένωση, την Αφρική και την Άπω Ανατολή. Στην Ελλάδα έχουν απομονωθεί από άνθρωπο καθώς και από κρότωνες στελέχη ρικετσιών της ομάδας του Κηλιδοβλατιδώδους Πυρετού (spotted fever group, SFG), καθώς και του Εξανθηματικού Τύφου, ενώ περιστατικά της νόσου έχουν αναφερθεί και στις γειτονικές χώρες. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανίχνευση αφενός γενετικού υλικού ρικετσιών σε ασθενείς της Βορείου Ελλάδας, και αφετέρου γενετικού υλικού ρικετσιών της ομάδας του Κηλιδοβλατιδλώδους Πυρετού σε κρότωνες της ίδιας περιοχής. Ακολούθως ο γενετικός χαρακτηρισμός των ειδών ρικετσιών που έχουν ανιχνευτεί από ασθενείς και κρότωνες καθώς επίσης και η μοριακή επιδημιολογία της νόσου στη χώρα μας και η σύγκριση των ειδών ρικετσιών που κυκλοφορούν στην Ελλάδα με αυτά χωρών της Μεσογείου. Επίσης σκοπός της μελέτης ήταν και ο ορολογικός έλεγχος των ύποπτων για ρικετσιώσεις ασθενών. Το υλικό της μελέτης αποτελούνταν από α) 342 δείγματα ορού αίματος ασθενών με υπόνοια λοίμωξης με ρικέτσιες, β) 31 δείγματα ολικού αίματος ασθενών με υπόνοια λοίμωξης με ρικέτσιες, οι οποίοι νοσηλεύθηκαν σε διάφορα νοσοκομεία της Β. Ελλάδας, γ) 2.337 κρότωνες που συλλέχθηκαν από όλους τους νομούς της Β. Ελλάδας. Εφαρμόστηκαν ορολογικές και μοριακές μέθοδοι. Για την ορολογική μελέτη εφαρμόστηκε ο έμμεσος ανοσοφθορισμός. Στα δείγματα ολικού αίματος ασθενών με κλινική εικόνα ύποπτη για λοίμωξη με ρικέτσιες, εφαρμόστηκαν 3 διαφορετικά πρωτόκολλα για την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης. Οι κρότωνες διαχωρίστηκαν σε ομάδες ανάλογα με το είδος, το φύλο, το αναπτυξιακό στάδιο και την περιοχή προέλευσής τους. Απομονώθηκε το γενετικό τους υλικό και εφαρμόστηκαν τα πρωτόκολλα της PCR. Από τον ορολογικό έλεγχο των 315 ασθενών με υπόνοια λοίμωξης με ρικέτσιες βρέθηκε ότι ποσοστό 45,7% είχε παλαιά λοίμωξη, το 57,6% έναντι της ομάδας του Kηλιδοβλατιδώδους Πυρετού και το 42,4% έναντι της ομάδας του Eξανθηματικού Tύφου. Το 17,1% των ασθενών είχαν πρόσφατη λοίμωξη με ρικέτσια εκ των οποίων το 90,7% με ρικέτσια της ομάδας του Kηλιδοβλατιδώδους Πυρετού και το 9,3% με ρικέτσια της ομάδας του Eξανθηματικού Tύφου (p< 0,001). Όσο αναφορά την κλινική συμπτωματολογία των ασθενών με πρόσφατη λοίμωξη, το εξάνθημα παρατηρήθηκε συχνότερα σε ενήλικες (26/44, 60%) από ότι σε παιδιά (0%), ενώ η διόγκωση λεμφαδένων ήταν πιο συχνή στα παιδιά (4/10, 40%) από ότι στους ενήλικες (2/44, 4,5%). O μοριακός έλεγχος για την ανίχνευση γενετικού υλικού ρικέτσιας στους 31 ασθενείς με υπόνοια λοίμωξης από ρικέτσιες απέβει αρνητικός. Για το λόγο αυτό η μελέτη βασίστηκε κυρίως στην ορολογική διάγνωση της νόσου. Όσον αφορά τους κρότωνες, θετικές για ρικέτσιες βρέθηκαν τρεις ομάδες κροτώνων του γένους Rhipicephalus (turanicus και bursa) και δύο του γένους Ixodes (gibbosus). Η πρώτη θετική ομάδα κροτώνων Rhipicephalus turanicus είχε συλλεγεί από το Μετόχι του νομού Σερρών το 2004. Η δεύτερη θετική ομάδα κροτώνων Rh. bursa συλλέχθηκε από το Λιθότοπο Σερρών το 2006 και η τρίτη ομάδα Rh. bursa συλλέχθηκε από τη Γαλάτιστα Χαλκιδικής το 2006. Οι δυο ομάδες I. gibbosus που βρέθηκαν θετικές για ρικέτσια είχαν συλλεγεί στο χωριό Παναγίτσα του νομού Πέλλης το 2005. Η ανεύρεση της αλληλουχίας των βάσεων στα προïόντα των PCR έδειξε ότι η πρώτη θετική ομάδα κροτώνων που συλλέχθηκαν στο Μετόχι Σερρών ήταν μολυσμένη με R. massiliae, η δεύτερη (Λιθότοπος Σερρών) και η τρίτη (Γαλάτιστα Χαλκιδικής) με R. slovaca. Η αλληλούχιση των νουκλεοτιδίων του προïόντος της PCR των δύο θετικών ομάδων κροτώνων I. gibbosus έδειξε ότι είναι μολυσμένοι με R. endosymbiont της Haemaphysalis sulcata. Συμπερασματικά, η συχνότητα της μόλυνσης των κροτώνων με παθογόνες ρικέτσιες είναι χαμηλή (0,12%) στη Β. Ελλάδα, ενώ υπάρχουν ορισμένες ενδημικές περιοχές (στους νομούς Χαλκιδικής και Σερρών). Επίσης φάνηκε ότι στη Β. Ελλάδα κυκλοφορούν οι παθογόνες ρικέτσιες R. conorii, R. massiliae, R. slovaca, ενώ από το σύνολο των αποτελεσμάτων και των βιβλιογραφικών δεδομένων φαίνεται ότι στην Ελλάδα κυκλοφορούν ρικέτσιες που ανήκουν και στις δύο ομάδες, την ομάδα του Κηλιδοβλατιδώδους Πυρετού και την ομάδα του Εξανθηματικού Τύφου. Από την ομάδα του Κηλιδοβλατιδώδους Πυρετού, οι παθογόνες για τον άνθρωπο ρικέτσιες που κυκλοφορούν στην Ελλάδα είναι η R. conorii, η R. massiliae, η R. slovaca, η R. mongolotimonae, η R. rhipicephali, και η R. aeschlimannii, ενώ από την ομάδα του Εξανθηματικού Τύφου κυκλοφορεί η R. typhi.