Μελέτη του ρόλου της Pim-2 στην απόπτωση κυττάρων που εκτίθενται σε παράγοντες επαγωγής οξειδωτικού στρες και σε κυτταροκίνες

Abstract

The regulatory mechanisms of cell death are of the same importance in carcinogenesis as the control mechanisms of cell proliferation. Oxidative stress induces a plethora of biological responses that determine whether a cell will undergo necrosis, senescence, apoptosis or will survive and proliferate. An important oxidative damage mediator is H₂O₂, which activates, among others, NF-κB signaling pathways. A protein kinase that has an important role in cell proliferation and survival is Pim-2, that belongs to the serine/threonine Pim protein kinase family and is an NF-κB target gene, a redox-sensitive nuclear transcription factor. Pim-2 is over-expressed in different cancer types and although its role in cellular apoptosis by many stimuli has been studied and its anti-apoptotic activity well documented, its functional role in cell proliferation remains controversial. The aim of the present study was to investigate the role of protein kinase Pim-2 in cell cycle progression and on stress-induced apoptosis by H₂O₂, in telomerised human fibroblasts MRC-5 TERT and human lung tumour epithelial cells A549. To this end, stable cell populations or clones were generated carrying either a control vector BIB, or a wild-type (wt) [BIB/Pim-2(wt)] or a dominant-negative (DN) [BIB/Pim-2(DN)] human Pim-2 cDNA. First, we showed that expression of Pim-2 resulted in a delay in cell cycle progression at the G2-M cell cycle phase of the potentially immortalized lung fibroblasts MRC-5 TERT (and normal fibroblasts IMR-90) but not in tumour lung epithelial cells A549, inducing the up-regulation of cyclins A and B1, the transcrioptionally inactive FoxM1A isoform, which act as a dominant-negative variant to slow down cell proliferation and the induction of the p53 - p21Cip1/Waf1 axis that contribute to up-regulation of GADD45a and 14-3-3σ, two p53 target-proteins. Since Pim-2 is regulated by NF-κB, a redox-sensitive nuclear transcription factor, we next investigated the role of Pim-2 on H₂O₂-mediated effects on cell proliferation and apoptosis of MRC-5 TERT and A549 cells. First we showed that H₂O₂ induced apoptosis of MRC-5 TERT cells and up-regulated the expression of Pim-2, dose dependently, probably through the activation of NF-κB. Both Pim-2(wt)-expressing, but not Pim-2(DN), MRC-5 TERT and A549 cells displayed an increased accumulation in G2-M cell cycle phase. Among the common and important changes invoking a G2-M arrest in response to H₂O₂ were the up-regulation of the p53 - p21Cip1/Waf1 axis and of GADD153/CHOP, a member of the CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBPs) and a cell cycle controlling and DNA damage response protein, the level of which correlates with ER stress, delaying cell proliferation in G1-S and G2-M cell cycle phases. These findings were important as the induction of p53 - p21Cip1/Waf1 axis is involved in the control of G1-S and G2-M cell cycle phases, and in the induction of apoptosis, and these anti-proliferative responses are depended on the intensity of the stimulus. Induction of GADD153 was also important given its dual role in ROS-induced apoptosis through the mitochondrial pathway but also in G2-M arrest. While H₂O₂ mediated apoptosis of control cells, Pim-2(wt)-expressing cells displayed a resistant phenotype to H₂O₂-mediated apoptosis. This resistant phenotype was conferred by Pim-2(wt) most likely due to its ability to delay cell cycle progression in G2-M phase and to inactivate anti-apoptotic factors thereby giving cells time to repair their damaged DNA before an irreversible cell death response can become invoked, a function analogous to canonical IKKβ/NF-κB signaling pathway.

Οι μηχανισμοί ρύθμισης του κυτταρικού θανάτου παίζουν εξίσου σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση με τους μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Το οξειδωτικό στρες επάγει διάφορες βιολογικές αποκρίσεις οι οποίες καθορίζουν αν ένα κύτταρο θα εισέλθει στη διαδικασία της νέκρωσης, της γήρανσης, της απόπτωσης ή θα επιβιώσει και θα πολλαπλασιαστεί. Ένας σημαντικός μεσολαβητής στην οξειδωτική βλάβη είναι το H₂O₂. Μια πρωτεϊνική κινάση η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την κυτταρική επιβίωση και τη διαφοροποίηση είναι η Pim-2, η οποία ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/θρεονίνης Pim και αποτελεί γονίδιο-στόχου του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα NF-κB, ενός παράγοντα ευαίσθητου στις οξειδο-αναγωγικές μεταβολές του κυττάρου. Η Pim-2 υπερεκφράζεται σε διαφόρους καρκινικούς τύπους και μολονότι ο ρόλος της στην κυτταρική απόπτωση που επάγεται από πολλά ερεθίσματα έχει μελετηθεί και αναδειχθεί η αντι-αποπτωτική δράσης της, ο ρόλος της Pim-2 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό δεν έχει αποσαφηνιστεί. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου της πρωτεϊνικής κινάσης Pim-2 στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και τη στρεσο-επαγόμενη απόπτωση από το H₂O₂, ανθρώπινων τελομερισμένων ινοβλαστών MRC-5 TERT και καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα Α549. Για το σκοπό αυτό κατασκευάσθηκαν σταθεροί κυτταρικοί πληθυσμοί ή κλώνοι που έφεραν είτε έναν πρότυπο φορέα ελέγχου, BIB, την αγρίου-τύπου Pim-2(wt) [BIB-Pim-2(wt)] ή μια κυρίαρχη αρνητική μορφή της, την Pim-2(DN) [BIB-Pim-2(DN)]. Αρχικά, δείξαμε ότι η έκφραση της Pim-2 προκάλεσε την επιβράδυνση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2-M των δυνητικά αθανατοποιημένων ινοβλαστών πνεύμονα MRC-5 TERT (και φυσιολογικών ινοβλαστών IMR-90) αλλά όχι των καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα Α549 επάγοντας την αυξορρύθμιση των κυκλινών Α και Β1, της μεταγραφικά ανενεργής ισομορφής FoxM1A ή οποία δρα ως κυρίαρχη αρνητική μορφή στην επιβράδυνση του κυτταρικού κύκλου, και του άξονα p53 - p21Cip1/Waf1 που οδήγησε στην αυξορρύθμιση των GADD45a και 14-3- 3σ, που αποτελούν πρωτεΐνες-στόχους της p53. Επειδή η Pim-2 ρυθμίζεται από τον NFκ-B, ο οποίος είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας ευαίσθητος στις οξειδο-αναγωγικές μεταβολές, χορηγήσαμε H₂O₂ στα κύτταρα MRC-5 TERT και A549. Το H₂O₂ επήγαγε την Pim-2, πιθανά διαμέσου της ενεργοποίησης του NF-κB και επομένως διερευνήθηκαν στη συνέχεια οι επιδράσεις της Pim-2 στον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση των κυττάρων MRC-5 TERT και Α549 ως απόκριση στο οξειδωτικό στρες. Η Pim-2(wt) αλλά όχι η Pim-2(DN) επαύξησε τη συσσώρευση και των δύο κυτταρικών τύπων MRC-5 TERT και A549 στη φάση G2-M του κυτταρικού κύκλου. Μεταξύ των σημαντικότερων κοινών μεταβολών υπεύθυνων για τη συσσώρευση και των δύο κυτταρικών τύπων στη φάση G2-M του κυτταρικού κύκλου ως απόκριση στο H₂O₂ ήταν η αυξορρύθμιση του άξονα p53 - p21Cip1/Waf1 καθώς επίσης και της GADD153 (ή CHOP), μέλος των μεταγραφικών παραγόντων (C/EBPs) που σχετίζεται με το στρες στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), και ελέγχει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου ως απόκριση σε βλάβες DNA, επιβραδύνοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στις φάσεις G1-S ή G2-M του κυτταρικού κύκλου. Αυτά τα ευρήματα ήταν σημαντικά καθώς η επαγωγή του άξονα p53 - p21Cip1/Waf1 εμπλέκεται στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις G1-S και G2-M, αλλά και στην επαγωγή της απόπτωσης, και αυτές οι δύο αντι-πολλαπλασιαστικές αποκρίσεις εξαρτώνται από την ένταση του ερεθίσματος. Η επαγωγή της GADD153 συμφωνεί με το διττό ρόλο της στην επαγωγή της απόπτωσης που προκαλείται από δραστικές μορφές οξυγόνου διαμέσου της μιτοχονδριακής πορείας GADD153, αλλά και στη διακοπή της προόδου του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2-M. Ενώ το H₂O₂ επήγαγε την απόπτωση των κυττάρων ελέγχου, τα κύτταρα που έφεραν την Pim-2(wt) επέδειξαν έναν φαινότυπο ανθεκτικό στην επαγόμενη απόπτωση από το H₂O₂. Η ανθεκτικότητα των κυττάρων που έφεραν την Pim-2(wt) στην επαγόμενη απόπτωση από το H₂O₂ πιθανά οφείλονταν στο ότι η Pim-2(wt) επιβράδυνε την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2-M δίνοντας έτσι χρόνο στα κύτταρα να επιδιορθώσουν τις βλάβες στο DNA πριν η συσσώρευση των βλαβών από τη χορήγηση του H₂O₂ οδηγήσουν στην μη-αναστρέψιμη καταστροφή των κυττάρων. Η δράση της Pim-2 που εξαρτάται από τον NF-κB είναι ανάλογη με τη δράση του NF-κB στις αποκρίσεις βλαβών στο DNA που οδηγεί στην αύξηση της κυτταρικής επιβίωσης.