Μοριακή ανίχνευση νοροϊών - πολιοϊών στο περιβάλλον. Εντοπισμός γενετικών ανασυνδυασμών και σύνδεσή τους με την αντιγραφική λειτουργία των ιϊκών στελεχών

Abstract

Polioviruses are members of the enterovirus genus, belonging to the Picornaviridae family. They are the causative agents of poliomyelitis, a paralytic and sometimes fatal disease in humans. The number of poliomyelitis cases caused by wild poliovirus infections has been drastically reduced by the extensive use of two available vaccines: the inactivated poliovirus vaccine (IPV) and the oral poliovirus vaccine (OPV). Despite the importance of OPV in the reduction of poliomyelitis cases, one of the disadvantages associated with this vaccine is the rare occurrence of vaccine-associated paralytic poliomyelitis (VAPP) in vaccinees or their healthy contacts through the accumulation of mutations and/or recombination in Sabin strains genome. Thirteen clinical isolates originating from healthy vaccinees and VAPP cases were initially investigated in order to identify genomic modifications in 5’ noncoding region (5’-NCR) and VP1 genomic regions. The analysis of samples was conducted by RT PCR, RFLP, sequencing and bioinformatics analysis. All clinical isolates were characterized as OPV-like viruses. Our results showed that analysis of 5’-NCR and VP1 regions of Poliovirus Sabin strains is important in order to identify mutations that increase neurovirulence and may eventually lead to the emergence of VAPP cases. Mutations at specific sites of the genome and recombination between Sabin strains may result in the loss of the attenuated phenotype of OPV strains and the acquisition of traits characteristic of wild polioviruses, such as increased neurovirulence and loss of temperature sensitivity. In this view, we determined the phenotypic traits such as temperature sensitivity and growth kinetics of fourteen OPV isolates (recombinant and non-recombinant). The growth phenotype of each isolate as well as of Sabin vaccine strains in Hep2 cell line at two different temperatures (37oC and 40oC) was evaluated using two different assays, RCT test (Reproductive Capacity at different Temperatures) and onestep growth curve analysis. Moreover, the nucleotide and amino acid positions in the genomes of the isolates that have been identified as being involved in the attenuated and thermo sensitive phenotype of Sabin vaccine strains were investigated. Mutations that result in loss of the attenuated and thermo sensitive phenotype of Sabin vaccine strains were identified in 5’-NCR, VP1 and 2C-3’NCR genomic regions of all isolates. Both mutations and recombination events correlated well with the reverted phenotypic traits of OPV-derivatives.

Στην παρούσα διατριβή, 13 δείγματα τα οποία απομονώθηκαν από υγιή εμβολιασμένα άτομα και άτομα με εμβολιοσυνδεόμενη παραλυτική πολιομυελίτιδα (VAPP) κατά την χρονική περίοδο 1978-2001, μελετήθηκαν για την παρουσία μεταλλάξεων σε ένα τμήμα της 5’-NCR περιοχής και σε ολόκληρη τη VP1 περιοχή. Ο γενότυπος των 13 κλινικών στελεχών προσδιορίστηκε ως Sabin 1 για δυο από αυτά και ως Sabin 2 για έντεκα από αυτά μέσω RFLP ανάλυσης στην 5’-NCR περιοχή. Επιπλέον όλα τα ιϊκά στελέχη χαρακτηρίστηκαν ως OPV-like ιοί καθώς εμφάνισαν < 1 % ποσοστό απόκλισης στην VP1 περιοχή από τα αντίστοιχα πρότυπα εμβολιακά στελέχη. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης δείχνουν ότι η αλληλούχιση των 5’-NCR και VP1 περιοχών είναι σημαντική για την μοριακή διάγνωση των πολιοϊών. Η ανάλυση αυτών των περιοχών δείχνει ότι εμβολιοσυνδεόμενοι πολιοϊοί είναι δυνατόν να εξελιχθούν σε μεταδόσιμα και μολυσματικά παθογόνα μέσω της συσσώρευσης μεταλλάξεων τόσο σε δομικά στοιχεία της VP1 (αντιγονικές θέσεις, περιοχή πρόσδεσης του κυτταρικού υποδοχέα) όσο και σε καθοριστές της εξασθένησης των Sabin εμβολιακών στελεχών στις 5’-NCR και VP1 περιοχές. Επιπλέον, συμπεραίνεται ότι δεν είναι σημαντικό μόνο το ποσοστό απόκλισης στην VP1 περιοχή αλλά κυρίως οι θέσεις όπου εντοπίζονται οι μεταλλάξεις. Ο χαρακτηρισμός εμβολιοσυνδεόμενων πολιοϊών που βασίζεται στις 5’-NCR και VP1 αλληλουχίες θα μπορούσε να δώσει επιπλέον πληροφορίες όσον αφορά την εξέλιξη των στελεχών αυτών. Επιπλέον, επιχειρήθηκε η συσχέτιση μεταλλάξεων και ανασυνδυασμών με την κινητική ανάπτυξης εμβολιοσυνδεόμενων πολιοϊών. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκαν 14 ιϊκά στελέχη εκ των οποίων 6 ιϊκά στελέχη έφεραν απλούς ανασυνδυασμούς, 6 ιϊκά στελέχη έφεραν διπλούς ανασυνδυασμούς και δύο ιϊκά στελέχη τα οποία δεν έφεραν ανασυνδυασμό. O φαινότυπος ανάπτυξης των εμβολιοσυνδεόμενων πολιοϊών προσδιορίστηκε σε δυο διαφορετικές θερμοκρασίες (37oC και 40oC) χρησιμοποιώντας δυο διαφορετικές μεθόδους και συγκρίθηκε με την ανάπτυξη των αντίστοιχων πρότυπων εμβολιακών στελεχών (Sabin 1, Sabin 2, Sabin 3). Συγκεκριμένα οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: i) το RCT τεστ (Reproductive Capacity at different Temperatures) το οποίο ορίζεται ως η διαφορά, μετά από επώαση 5 ημερών, ανάμεσα στο log10 του ιϊκού τίτλου που εκφράζεται σε TCID50 (50% tissue culture infective dose) ανά ml, στην ευνοϊκή (37οC) και στη μη ευνοϊκή θερμοκρασία (40οC) για την ιϊκή αναπαραγωγή και ii) η καμπύλη ανάπτυξης ενός σταδίου (one-step growth curve test) η οποία παρουσιάζει την ιϊκή ανάπτυξη κατά την διάρκεια των πρώτων 12 ωρών στους 37οC και 40οC μετά την μόλυνση κυττάρων με 10 ΜΟΙ (Multiplicity Of Infection) ή 10 TCID50/cell.