Παράγοντες που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό κυττάρων του αναπνευστικού συστήματος

Abstract

Chronic airway inflammatory diseases appear with a different frequency and severity in people with different genders. In these diseases increased cholinergic transmission is observed, as well as release of inflammatory and growth factors in the airway. Chronic airway diseases are often characterized by remodeling of the airway wall, in which an increase in SMC mass is observed. In the treatment of some of these diseases macrolides are used, due to not only their antmicrobial and anti-inflammatory effect, but also to their direct effect on the airway cells. The aim of the present study was to examine the effect of gender hormones, muscarinic agonists, inflammatory and growth factors as well as the antibiotic azithromycin, on the airway SMCs. Rabbit tracheal and human bronchial SMCs were used. The proliferation of SMCs was estimated using the radioactive thymidine incorporation and the Cell Titer 96® AQueous One Solution Assay method, which estimates cell number. The cell viability and the number of lysosomes were estimated with the biological dyes Trypan blue and Lysotracker red respectively. The signal pathways that are activated, were studied using pathway inhibitors as well as Western blot analysis, while intracellular proteins were tracked by indirect immunofluorescence. Gender hormones increase the male and female adult rabbit tracheal SMC proliferation, within the first 24h and their effect is mediated by classic androgen receptors and activation of the PI3K and MAPK signal pathways. Muscarinic agonists increase only rabbit SMC proliferation and their effect seems to be mediated by M3 muscarinic receptors and the PI3K and MAPK signal pathways. TNFα, TGF, bFGF and PDGF act as mitogens in human bronchial SMCs and increase the radioactive thymidine incorporation in rabbit tracheal SMCs, through activation of the above mentioned pathways, but have no synergetic effect with muscarinic agonists. Azithromycin inhibits the rabbit and human airway SMC proliferation and causes autophagy. Its effect on rabbit tracheal SMCs was dose-dependent and time-dependent and did not lead the cells to apoptosis, while in human bronchial SMCs it decrease the cell number. The results of the present study show that airway SMCs react towards a variety of factors that are present in the airways in normal and pathological conditions. The nature, the intensity and the duration of the stimuli determines the cellular response which includes activation of signal pathways leading to proliferation or activation of procedures necessary for cell survival. The effect of these stimuli is mediated by binding to cellular receptors and activating the PI3K and MAPK signal pathways. The way the cells react is depended on their source as well as the culture conditions.

Στις χρόνιες φλεγμονώδεις παθήσεις του αναπνευστικού εμφανίζεται διαφορά στη συχνότητα και τη βαρύτητα της νόσου σε άτομα διαφορετικού φύλου, αλλά και αυξημένη χολινεργική διαβίβαση, και απελευθέρωση φλεγμονωδών και αυξητικών παραγόντων. Οι χρόνιες νόσοι του αναπνευστικού συχνά χαρακτηρίζονται από αναδιαμόρφωση του τοιχώματος των αεραγωγών, στην οποία συμμετέχει και η αύξηση της μάζας των ΛΜΚ. Στην θεραπεία μερικών από αυτές τις παθήσεις χορηγούνται μακρολίδες, εξαιτίας όχι μόνο της αντιμικροβιακής και αντιφλεγμονώδους δράσης τους αλλά και λόγω της απευθείας επίδρασης τους στα κύτταρα των αεραγωγών. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η επίδραση των γεννητικών ορμονών, των μουσκαρινικών αγωνιστών, φλεγμονωδών και αυξητικών παραγόντων και της αζιθρομυκίνης, στα ΛΜΚ των αεραγωγών. Χρησιμοποιήθηκαν ΛΜΚ τραχείας κουνελιού και βρόγχων ανθρώπου. Ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με τη μέθοδο της ενσωμάτωσης ραδιενεργού θυμιδίνης σε νεοσυντιθέμενα μόρια DNA, και με τη μέθοδο Cell Titer 96® AQueous One Solution Assay, με την οποία εκτιμάται ο αριθμός των κυττάρων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων και ο αριθμός των λυσοσωμάτων εκτιμήθηκαν με χρώσεις με Trypan blue και Lysotracker red, αντίστοιχα. Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται, μελετήθηκαν με τη χρήση αναστολέων και με ανοσοαποτύπωση κατά Western, ενώ ενδοκυττάριες πρωτεΐνες εντοπίστηκαν με έμμεσο ανοσοφθορισμό. Οι γεννητικές ορμόνες επάγουν τον πολλαπλασιασμό ΛΜΚ τραχείας αρσενικού και θηλυκού κουνελιού τις πρώτες 24 ώρες της επώασης και η δράση τους μεσολαβείται μέσω των κλασικών υποδοχέων ανδρογόνων και των μονοπατιών της ΡΙ3Κ και των ΜΑΡΚ. Οι μουσκαρινικοί αγωνιστές επάγουν μόνο τον πολλαπλασιασμό των ΛΜΚ κουνελιού και η δράση τους φαίνεται να μεσολαβείται μέσω Μ3 μουσκαρινικών υποδοχέων και των μονοπατιών της ΡΙ3Κ και των ΜΑΡΚ. Οι παράγοντες TNFα, TGF, bFGF και PDGF έχουν μιτογόνο δράση σε ΛΜΚ βρόγχων ανθρώπου και επάγουν την ενσωμάτωση ραδιενέργειας από ΛΜΚ τραχείας κουνελιού, μέσω ενεργοποίησης των παραπάνω μονοπατιών, αλλά δεν εμφανίζουν συνεργική δράση με τους μουσκαρινικούς αγωνιστές. Η αζιθρομυκίνη ελάττωσε τον πολλαπλασιασμό και προκάλεσε αυτοφαγία σε ΛΜΚ αεραγωγών κουνελιού και ανθρώπου. Η δράση της στα ΛΜΚ τραχείας κουνελιού ήταν δοσοεξαρτώμενη, χρονοεξαρτώμενη και δεν οδήγησε σε απόπτωση, ενώ στα ΛΜΚ βρόγχων ανθρώπου ελάττωσε τον αριθμό των κυττάρων. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι τα ΛΜΚ των αεραγωγών αντιδρούν απέναντι σε μια πληθώρα παραγόντων, οι οποίοι βρίσκονται στους αεραγωγούς σε φυσιολογικές αλλά και παθολογικές καταστάσεις. Η φύση, η ένταση και η διάρκεια του ερεθίσματος καθορίζει την κυτταρική απόκριση που περιλαμβάνει ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών που οδηγούν το κύτταρο σε πολλαπλασιασμό ή σε ενεργοποίηση διαδικασιών απαραίτητων για την επιβίωσή του. Ο τρόπος με τον οποίο αντιδρούν τα κύτταρα εξαρτάται τόσο από την προέλευση τους αλλά και από τις συνθήκες της καλλιέργειας.