Φυσική χαρτογράφηση υψηλής ευκρίνειας στη χρωμοσωμική περιοχή 10q23 του ανθρώπου και συμβολή στη λειτουργική ανάλυση του γονιδίου neuralized

Abstract

This thesis consists of two parts. In the first, we describe the construction of a high resolution, sequence-ready physical map of the gene-rich q23.31-q23.33 region of human chromosome 10 and evaluate the information derived from the in silico analysis of the corresponding DNA sequence. In the second part, we present our work on structural, evolutionary and functional characteristics of the murine Neuralized ( Νeurl ) gene, the human NEURL ortholog located adjacently to the above region. By using as probes 36 STSs (Sequence Tag Sites) mapped to 10q23.31-q23.33, we isolated 22 PAC and 316 BAC chromosomal clones and proceeded to their structural analysis by means of comparative DNA fingerprinting. Our data led to the construction of a well-supported, sequence-ready unique contig of about 4.38 Mb delimited by the microsatellite markers D10S541 and D10S583, located proximal and distal to the centromere, respectively. The contig was used by the collaborating laboratory of Sanger Center, for the selection of a tiling path of 35 BACs, which were then employed in DNA sequence determination. The corresponding finished DNA sequence is without gaps and, as revealed by extensive in silico analysis, contains 51 genes, 35 of which are of unknown function. However, 11 of the latter encode polypeptides with distinctive domains present in proteins of known function. Recent studies from a number of groups including ours, have suggested that the drosophila neuralized (neur) participates in Notch signaling and that the mouse ortholog, Neurl, may play a regulatory role in various cellular functions. In order to further characterize Neurl , we isolated 17 phage clones from a mouse strain 129SV genomic library and determined the chromosomal organization of the gene. In combination with information from various databases, our experimental data suggested that Neurl spans 79 Kb of genomic DNA, consists of 7 exons and appears to be under the control of two distinct, alternatively used promoters, one of which is located in the 47.3 Kb long, intron 1. The gene encodes two Neurl polypeptides, 574 and 557 aa long, differing at their amino-terminus, as a result of the alternative use of exon 1 and the downstream exon 1a. Extensive comparative analysis at the nucleotide level suggested that the chromosomal organization of the gene is quite similar in insects and mammals and demonstrated possible Νeurl regulatory elements in mammals. Moreover, systematic protein sequence comparisons among neuralized orthologs from several organisms, i.e.: C. elegans D. melanogaster, A. gambiae, F. rubripes, D. rerio, X. laevis, R. norvegicus, revealed that the “neuralized” protein family is well-conserved in multicellular animal species from the worm and insects to mammals, prominently at the characteristic NEUZ 1, 2 and RING domains. In particular, NEUZ1 represents the most conserved domain among vertebrates whereas the RING is the most conserved domain between vertebrate and invertebrate species. The latter, possibly suggests similar biochemical function of the protein in all species and demonstrates the central role of the RING domain. In order to further elucidate the biological role of Neurl, we employed the yeast two-hybrid system to identify proteins that directly interact with it. The screening resulted in the identification of 9 proteins known to participate in significant cell functions, i.e: motor-based intracellular transport, cell movement or stability (Dlc-1, Gas8, Evpl and ankycorbin), cell division or apoptosis (Numa1, Lek1, Dlc-1, Peg3), posttranslational protein modification (Ubc9) and transcriptional regulation (Dnmt3a).

H παρούσα διατριβή αποτελείται από δύο µέρη. Στο πρώτο, περιγράφουµε την κατασκευή ενός υψη- ευκρίνειας φυσικού χάρτη µε στόχο την αλληλούχηση της πλούσιας σε γονίδια περιοχής q23.31-q23.33 χρωµοσώµατος 10 του ανθρώπου και αξιοποιούµε την πληροφορία που προκύπτει από την in silico ανά- λυση της αντίστοιχης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Στο δεύτερο, παρουσιάζουµε τη µελέτη δοµικών, εξελι- κτικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών του γονιδίου Νeuralized (Neurl) του ποντικού, ορθόλογου του αν- θρώπινου ΝΕURL, που χαρτογραφείται πλησίον της παραπάνω χρωµοσωµικής περιοχής. Χρησιµοποιώντας ως ανιχνευτές 36 STSs (Sequence Tag Sites), που χαρτογραφούνται στην περιοχή 10q23.31-q23.33, αποµονώσαµε 22 και 316 χρωµοσωµικούς κλώνους PAC και BAC, αντίστοιχα. Ο δοµικός χαρακτηρισµός των κλώνων έγινε µε σύγκριση του προτύπου τεµαχισµού τους µε διάφορα περιοριστικά έν- και έτσι δηµιουργήθηκε ένα ενιαίο, ιδιαίτερα αξιόπιστο contig κλώνων µήκους 4.38 Mb, που ορίζεται τους µικροδορυφορικούς γενετικούς δείκτες D10S451 και D10S583, που τοποθετούνται εγγύς και άπω κεντροµερούς, αντίστοιχα. Με βάση αυτό το contig, επιλέχθηκαν από το συνεργαζόµενο εργαστήριο του Sanger Center 35 κλώνοι BAC, οι οποίοι διατρέχουν τη συγκεκριµένη χρωµοσωµική περιοχή και έχουν τη µι- κρότερη δυνατή επικάλυψη. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία που προέκυψε από την ανάλυση αυτών των κλώ- είναι ενιαία καθ’ όλο το µήκος του contig. Όπως προσδιορίστηκε µετά από συστηµατική ανάλυση in silico, η περιοχή που περικλείεται από τους ανωτέρω δείκτες περιέχει 51 γονίδια, 35 από τα οποία είναι άγνωστης λειτουργίας. Από τα τελευταία, 11 κωδικοποιούν πολυπεπτίδια που φέρουν χαρακτηριστικές περιο- οµολογίας µε πρωτεΐνες γνωστής λειτουργίας. Πρόσφατες αναφορές µιας σειράς ερευνητικών οµάδων, συµπεριλαµβανοµένης και της δικής µας, έχουν προτείνει ότι η πρωτεΐνη neuralized της δροσόφιλας συµµετέχει στη σηµατοδότηση Notch και ότι η ορθόλογη πρωτεΐνη Neurl του ποντικού πιθανόν να έχει ρυθµιστικό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές λειτουρ- Με σκοπό τoν περαιτέρω χαρακτηρισµό του Neurl , αποµονώσαµε 17 κλώνους βακτηριοφάγου από µια γονιδιωµατική βιβλιοθήκη ποντικού (στέλεχος 129SV) και προσδιορίσαµε τη χρωµοσωµική οργάνωση του γονιδίου. Με βάση τα πειραµατικά µας αποτελέσµατα σε συνδυασµό µε πληροφορίες από διάφορες βάσεις µένων, το γονίδιο εκτείνεται σε 79 Kb χρωµοσωµικής αλληλουχίας, αποτελείται από 7 εξόνια και φαίνε- ότι ελέγχεται από δύο διαφορετικούς, εναλλακτικά χρησιµοποιούµενους υποκινητές, ο ένας από τους οποίους βρίσκεται εντός του πρώτου ιντρονίου, µήκους 47.3Κb. To γονίδιο κωδικοποιεί δύο πολυπεπτίδια Neurl, µήκους 574 και 557 αµινοξέων, που διαφέρουν στο αµινοτελικό τους άκρο, λόγω της χρήσης των εξο- 1 και 1α από τους δύο εναλλακτικούς υποκινητές. Λεπτοµερής συγκριτική ανάλυση στο νουκλεοτιδικό επίπεδο έδειξε ότι η χρωµοσωµική οργάνωση του γονιδίου είναι παρόµοια στα έντοµα και στα θηλαστικά και επισήµανε πιθανά ρυθµιστικά στοιχεία του γονιδίου των θηλαστικών. Αντίστοιχα, από τη συστηµατική σύ- γκριση της αµινοξικής αλληλουχίας των ορθόλογων πρωτεϊνών µιας σειράς οργανισµών (C. elegans, D. melanogaster, A. gambiae, F. rubripes, D. rerio, X. Laevis, R. norvegicus) αποκαλύφθηκε ότι η οικογένεια των πρωτεϊνών neuralized είναι αρκετά συντηρηµένη στους ζωικούς οργανισµούς από τον νηµατώδη και τα έντοµα έως τα θηλαστικά, εµφανίζοντας υψηλότερη συντήρηση στις χαρακτηριστικές περιοχές NEUZ1, 2 και RING. Συγκεκριµένα, το NEUZ1 είναι η πιο συντηρηµένη περιοχή του Neurl στα σπονδυλωτά, ενώ το RING είναι η πιο συντηρηµένη περιοχή µεταξύ σπονδυλωτών και ασπόνδυλων.