Παρασκευή και μελέτη της επίδρασης ακινητοποιημένων συζευγμάτων πρωτεΐνης - θυροξίνης στον ενζυμοανοσοπροσδιορισμό της ελεύθερης θυροξίνης στον ανθρώπινο ορό

Abstract

One-step analog-based immunoassays of free thyroxine (FT4) are now widely used for the determination of FT4 in serum. They are based on the assumption that the T4-analog will compete with FT4 for binding to a specific anti-T4 antibody. A critical feature of these methods is that the T4-analog must not bind to thyroxine-binding proteins in serum. T4-analogs are synthesized by chemical modification of T4 or by conjugation of T4 with proteins.The reliability of the current analog-based FT4 immunoassays has been improved, as compared to the former ones. This improvement has been ascribed, at least in part, to the use of T4-analogs as solid-phase reagents instead of liquid-phase tracers. It has been suggested that the attachment of the analog to solid support creates a “macroanalog”, which may have substantially different properties from the same analog in liquid phase and thus, binds less to serum albumin. However, to our knowledge, no experimental evidence supporting this assumption has been reported in the literature. In addition, the diversity of assay formats, assay parameters and reagents of the commonly used FT4 immunoassays make it difficult to understand the role of the analog characteristics on the reliability of the assay. In this work, we investigated the effect of the physicochemical characteristics of immobilized T4-protein conjugates on the reliability of one-step solid-analog enzyme-immunoassays for FT4. The results of this investigation were used for the development of a reliable one-step solid-analog enzyme-immunoassay for FT4. T4-protein conjugates of different MW (1,6 / 105 Da - 1,0 / 106 Da) were prepared and used either as solid-phase reagents or as liquid-phase radiolabeled analogs, in order to gain insight information concerning the properties of the immobilized conjugates, as compared to the properties of the liquid-phase labeled conjugates. It was found that the presence of albumin in the serum sample at concentrations up to 120 g/L slightly decreased the antibody binding to the immobilized conjugates (less than 10%). In addition, this decrease was independent of both the MW and the T4-to-protein molar ratio of the conjugates. On the other hand, using same conjugates as liquid-phase labeled analogs, the observed decrease ranged between 2% and 33%, depending on the MW of the conjugate. The immobilization of conjugates eliminated the strong dependency of the albumin effect on the MW of the conjugates that was encountered in case of liquid-phase labeled analogs. These findings support the “macroanalog” hypothesis. It was also found that the conjugation method, used for the T4-protein conjugate synthesis, affected the observed albumin effect. When p-benzoquinone (PBQ) was used as bifunctional reagent, the albumin effect was insignificant, whereas in the case of glutaraldehyde the observed albumin effect was greater. We developed one-step enzyme-immunoassay for the determi­nation of FT4 in serum, which was based on a T4-gamma-globulin (T4-gamma-G) conjugate, prepared by the PBQ conjugation method, and a biotinylated monoclonal anti-T4 antibody. The T4-gamma-G conjugate was selected for our application since it binds insignificantly to thyroxine-binding proteins. The developed one-step solid-analog enzyme-immunoassay fulfilled all the requirements for FT4 immunoassay reliability. It was insignificantly affected by the serum binding protein concentration and the serum free fatty acid concentration. The sampling of the antibody was less than 1 %, and the sample dilution effect was in the expected range. The determination of the analytical characteristics of the immunoassay showed that the developed enzyme-immunoassay is reliable and sensitive. The FT4 concentration in euthyroid, hypothyroid and hyper­thyroid samples was determined, as well as the FT4 concentration in samples of pregnant women and euthyroid non-thyroidal illness patients. The developed FT4 immunoassay was very well correlated with a commercially available one-step solid-analog radioimmunoassay for FT4, as well as the commercially available equilibrium dialysis method for FT4.

Οι ανοσοπροσδιορισμοί ενός σταδίου της ελεύθερης θυροξίνης (FT4) βασίζονται στον ανταγωνισμό μεταξύ της FT4 του δείγματος και ενός αναλόγου της θυροξίνης (Τ4) για περιορισμένο αριθμό θέσεων δέσμευσης του ειδικού αντισώματος. Απαραίτητη προϋπόθεση για την αξιοπιστία των μεθόδων αυτών είναι η αμελητέα σύνδεση του αναλόγου της Τ4 με τις δεσμευτικές πρωτεΐνες του ορού. Η αξιοπιστία των ανοσοπροσδιορισμών της FT4 που χρησιμοποιούν ανάλογο της Τ4 είναι βελτιωμένη στις νεότερες μεθόδους. Η βελτίωση αυτή έχει εν μέρει αποδοθεί στη χρησιμοποίηση των αναλόγων ως αντιδραστηρίων στερεάς φάσεως. Έχει προταθεί ότι η ακινητοποίηση του αναλόγου δημιουργεί ένα «μακροανάλογο», το οποίο ίσως έχει διαφορετικές ιδιότητες από το ίδιο ανάλογο στην υγρή φάση και ίσως συνδέεται λιγότερο με τις δεσμευτικές πρωτεΐνες του ορού, κυρίως με την αλβουμίνη. Δεν έχει ωστόσο αναφερθεί στη βιβλιογραφία κάποια πειραματική απόδειξη της υπόθεσης αυτής. Είναι επομένως δύσκολο να αποσαφηνιστεί αν η βελτίωση της αξιοπιστίας στις νεότερες ανοσοχημικές μεθόδους, που χρησιμοποιούν ανάλογο της Τ4, οφείλεται στην ακινητοποίηση του αναλόγου στη στερεά φάση ή/και στα φυσικοχημικά του χαρακτηριστικά. Η μεγάλη διαφοροποίηση που παρατηρείται μεταξύ των μεθόδων ως προς τον τύπο του ανοσοπροσδιορισμού, το είδος του ιχνηθέτη, τα αντιδραστήρια και τα ρυθμιστικά διαλύματα, περιορίζει τη δυνατότητα άμεσων συγκρίσεων μεταξύ των αναλόγων. Η δυνατότητα αυτή περιορίζεται ακόμη περισσότερο από την έλλειψη βιβλιογραφικών αναφορών σχετικά με την επίδραση των φυσικοχημικών χαρακτη­ριστικών των αναλόγων της Τ4 στην αξιοπιστία των ανοσοχημικών προσδιορισμών της FT4. Στην παρούσα εργασία μελετάται η επίδραση των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών ακινητοποιημένων πρωτεϊνικών συζευγμάτων της Τ4 στον ενζυμο­ανοσοπροσδιορισμό ενός σταδίου για τη FT4. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής αξιοποιήθηκαν για την ανάπτυξη αξιόπιστης ενζυμοανοσοχημικής μεθόδου στερεάς φάσεως και ενός σταδίου για τον προσδιορισμό της FT4. Παρασκευάστηκαν πρωτεϊνικά συζεύγματα της Τ4 με μοριακό βάρος από 1,6 / 105 Da (Τ4-τρανσφερρίνη-2) έως 1,0 / 106 Da (Τ4-γ-σφαιρίνη). Βρέθηκε ότι η επίδραση της αλβουμίνης στην ικανότητα σύνδεσης του ειδικού αντισώματος με τα ακινητοποιημένα πρωτεϊνικά συζεύγματα της Τ4 ήταν αμελητέα, ακόμη και σε συγκεντρώσεις αλβουμίνης 120 g/L στον ορό, και ήταν ανεξάρτητη από το μοριακό βάρος του ακινητοποιημένου συζεύγματος. Τα ακινητοποιημένα συζεύγματα της Τ4 συγκρίθηκαν με τα ίδια συζεύγματα επισημασμένα στην υγρή φάση και βρέθηκε ότι η ακινητοποίηση των συζευγμάτων της Τ4 ελαχιστοποιεί την επίδραση της αλβουμίνης. Η πειραματική αυτή παρατήρηση ενισχύει την υπόθεση του «μακροαναλόγου». Επίσης, βρέθηκε ότι η επίδραση της αλβουμίνης εξαρτάται από τη χημεία σύνδεσης της Τ4 με την πρωτεΐνη-φορέα. Στην περίπτωση που η σύζευξη έγινε μέσω π-βενζοκινόνης (PBQ), η επίδραση της αλβουμίνης ήταν αμελητέα. Αντίθετα, όταν η σύζευξη έγινε μέσω γλουταραλδεΰδης, η αντίστοιχη επίδραση ήταν ιδιαίτερα σημαντική. Τέλος, η μοριακή αναλογία Τ4-προς-πρωτεΐνη των ακινητοποιημένων συζευγμάτων της Τ4 δε σχετίζεται με την επίδραση της αλβουμίνης. Αξιοποιώντας τα παραπάνω συμπεράσματα, αναπτύχθηκε ενζυμοανοσο­προσδιορισμός ενός σταδίου της FT4, όπου ως αντιδραστήριο στερεάς φάσεως χρησιμοποιήθηκε το σύζευγμα Τ4-γ-σφαιρίνη, παρασκευασμένο μέσω PBQ. Ο προσδιορισμός της FT4 με την αναπτυχθείσα μέθοδο πληρούσε όλες τις προϋποθέσεις για την αξιοπιστία του (αμελητέα επίδραση των θυρεοδεσμευτικών πρωτεϊνών του ορού, αμελητέα επίδραση αυξημένης συγκέντρωσης ελεύθερων λιπαρών οξέων, αναμενόμενη επίδραση της αραίωσης του δείγματος και σύνδεση του αντισώματος με λιγότερο από το 1 % της ολικής Τ4 του ορού). Η αναπτυχθείσα ενζυμοανοσοχημική μέθοδος ενός σταδίου για τον προσδιορισμό της FT4 βρέθηκε ότι είναι αξιόπιστη, ευαίσθητη και ακριβής. Με την αναπτυχθείσα μέθοδο προσδιορίστηκε η FT4 στον ορό διαφορετικών ομάδων ατόμων (ευθυρεοειδικοί, υποθυρεοειδικοί, υπερθυρεοειδικοί, έγκυες, νεφροπαθείς και καρδιοπαθείς). Βρέθηκε ότι η αναπτυχθείσα μέθοδος συσχετίζεται πολύ καλά με εμπορικά διαθέσιμη ραδιοανοσοχημική μέθοδο ενός σταδίου, καθώς και με την εμπορικά διαθέσιμη μέθοδο αναφοράς για τον προσδιορισμό της FT4.