ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΑΜΒΛΥΝΣΗΣ ΤΟΥ ΚΥΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΓΟΝΑΔΟΤΡΟΦΙΝΩΝ (GONADOTROPHINSURGE ATTENUATING FACTOR - GNSAF) ΑΠΟ ΩΟΘΥΛΑΚΙΚΟ ΥΓΡΟ ΓΥΝΑΙΚΩΝ

Abstract

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΗΤΑΝ Η ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΑΜΒΛΥΝΣΗΣ ΤΟΥ ΚΥΜΑΤΟΣ ΤΩΝΓΟΝΟΔΟΤΡΟΦΙΝΩΝ (GNSAF) ΑΠΟ ΩΟΘΥΛΑΚΙΚΟ ΥΓΡΟ ΓΥΝΑΙΚΩΝ. ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ GNSAF ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ ΤΟ IN VITRO ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΠΡΩΤΟΓΕΝΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΥΠΟΦΥΣΗΣ ΕΠΙΜΥΩΝ. Η ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ GNSAF ΕΚΦΡΑΖΕΤΑΙ ΩΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΗ ΕΛΑΤΤΩΣΗ ΤΗΣ ΕΚΚΡΙΣΗΣ ΤΗΣ LH ΤΩΝ ΥΠΟΦΥΣΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΜΕ GNRH. ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ GNSAF ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΕ ΑΠΟ 250 ML ΩΟΘΥΛΑΚΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ ΓΥΝΑΙΚΩΝ. ΑΠΟ ΤΟ ΩΟΘΥΛΑΚΙΚΟ ΥΓΡΟ ΑΦΑΙΡΕΘΗΚΑΝ ΟΙ ΣΤΕΡΟΕΙΔΕΙΣ ΟΡΜΟΝΕΣ ΚΑΙ ΑΚΟΛΟΥΘΗΣΕ ΘΕΡΜΑΝΣΗ (80C, 5MIN), ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ HEPARIN-SEPHAROSE ΚΑΙ CON-A, ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΣΕ ΣΤΗΛΗ ΑΝΑΣΤΡΟΦΟΥ ΦΑΣΕΩΣ RYDAC C4 ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΥΠΟ ΜΗ ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ. ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΤΑ 6 ΑΥΤΑ ΣΤΑΔΙΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ Η ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ GNSAF ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΕ ΣΕ ΜΙΑ ΟΜΟΙΟΓΕΝΗ ΠΡΩΤΕ~ΝΙΚΗ ΖΩΝΗ,ΟΠΩΣ ΕΔΕΙΞΕ Η ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕ~ΝΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΥΠΟ ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ. ΒΑΣΕΙ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΥΤΩΝ Ο GNSAF ΕΙΝΑΙ ΕΝΩΣΗ ΑΝΘΕΚΤΙΚΗ ΣΤΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΤΩΝ 80C, ΓΛΥΚΟΠΡΩΤΕ~ΝΗ (Η ΔΡΑΣΤΙΚΚΟΤΗΤΑ ΑΝΙΧΝΕΥΘΗΚΕ ΣΤΑ ΔΕΣΜΕΥΜΕΝΑ ΚΛΑΣΜΑΤΑ ΤΗΣ ΣΤΗΛΗΣ CON-A), ΑΝΘΕΚΤΙΚΗ ΣΤΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥΣ ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΜΕ ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ 12,5 KDA. ΜΕΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

THE PURPOSE OF THE DISSERTATION WAS TO ISOLATE GNSAF BIOACTIVITY (SUPPRESSIONOF THE PITVITARY RESPONSE TO GNRH) FROM HUMAN FOLLICULAR FLUID. IN ORDER TOMEASURE GNSAF BIOACTIVITY RAT PITVITARY CELLS IN SHORT-TERM CULTURE WERE USED. GNSAF ACTIVITY WAS DEFINED AS THE SUPPRESSION OF GNRH-STIMULATED LH SECRETION. GNSAF ACTIVITY WAS PURIFIED FROM 250ML OF TWICE-FOLD STEROID EXTRACTEDHUMAN FOLLICULAR FLUID USING HEAT TREATMENT (80C, 5MIN) HEPARIN-SEPHAROSE AND CON-A CHROMATOGRAPHY, VYDAC C4 REVERSED OHASE HPLC AND ROD GEL NATIVE ELECTROPHORESIS. USING THESE SIX PURIFICATION STEPS, WE HAVE OBTAINED AN APPARENTLY HOMOGENOUS PREPARATION THAT STAINS AS A SINGLE BAND ON SDS -POLYACPYLA- MIDE GEL ELECTROPHORESIS. GNSAF IS A HEAT-RESISTANT MOLECULE AT 80C, A GLYCOPROTEIN -SINCE ITS ACTIVITY WAS RESOLVED IN THE BOUND FRACTIONS OF CON-A SEPHAROSE-, RESISTANT AFTER ACETONITRILE TREATMENT - THE PROTEIN WAS NOT DENATURATED BY THE ORGANIC SOLVENT USED IN RP-HPLC AND WITH AN APPARENT MOLECULAR WEIGHT OF 12,5 KDA. MICROSEQUENCE ANALYSIS BY MASS SPECTROMETRY OF THE GNSAF PROTEIN REVEALED IDENTITY TO THE C-TERMINAL FRAGMENT OF HUMAN SERUM ALBUMIN. THE GLYCOSYLATED SITES OF THE PROTEIN PROBABLY DO NOT AFFECT ITS ACTIVITY. THE MECHANISM BY WHICH GNSAF MAINTAINS PITUITARY IN A STATE OF LOW RESPONSIVENES TO GNRH IS UNCLEAR. PRELIMINARY STUDIES SHOWED THAT GNSAF SUPPRESSES GNRH SELF-PRIMING EFFECT, PROTEIN KINASE C IS NOT INVOLVED IN THE MECHANISM OF ACTION OF GNSAF, WHILE OESTRADIOL MAY PLAY A REGULATORY ROLE.